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衰老是植物生长发育的必经阶段,其主要目的在于将贮存在叶片中的营养物质进行回收和转移。由于叶片衰老可降低植物光合作用同化能力,因而它是制约农作物产量的一个重要因素。因此,对叶片衰老机制的研究,特别是通过筛选相关早衰突变体、克隆衰老相关基因具有重要的经济价值。
通过大规模筛选水稻日本晴T-DNA/Tos17插入突变群体库,我们获得一批与水稻衰老相关的突变体,其中之一表现为黄叶早衰,命名为es1。我们构建了日本晴和ZF802杂交的F2代分离群体。利用图位克隆方法,通过SSR标记和STS标记相结合,将水稻早衰基因OsES1初步定位在第5号染色体的两个STS标记C53357和S5470之间。这两个标记之间的物理距离大约为3 Mb。随后,通过扩大群体和设计新的STS标记,将该基因精细定位在BAC克隆AC104709大约54 kb范围内。对该区域8个候选基因PCR分析测序发现,一个预测基因在该突变体中有一段4,114 bp的来自水稻一类经典的反转座子Tos17的插入序列。不仅如此,在其他2个等位突变体中,该候选基因的不同位点也存在同一反转座予插入序列。该基因在NCBI数据库中预测含有一个泛素缀合蛋白(ubiquitinconjugating enzyme,E2)的编码区。
另外,我们通过TAIL-PCR方法进行水稻T-DNA插入突变体侧翼序列的扩增。到目前为止,除去T-DNA或载体骨架序列,侧翼序列的全部测序结果中共得到432个水稻基因组侧翼序列,并据此初步总结了T-DNA在水稻基因组中整合规律。T-DNA插入基因间比例44.3%,插入基因内部的比例是39.2%。插入重复序列中比例最少。这些侧翼序列并不是平均分布在这12条染色体上,而是有其偏好性。其中1号,2号,3号染色体上T-DNA插入的频率明显高于其他染色体,而12号染色体最低。这些插入基因间重复区域的侧翼序列大多集中在3号染色体上。插入外显子的T-DNA大多集中在1号染色体上。由左臂特异引物扩增出的侧翼序列中,T-DNA左边界的序列大多都能找到。然而对由右臂特异引物扩出的侧翼序列进行分析发现,与左臂不同的是,在考察的所有结果中,右臂的边界序列均没有找到。这说明T-DNA在整合进水稻基因组时,右边界序列比左边界更容易缺失。这与以往报道均有很大不同。