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原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma)是全世界流行最广泛的恶性肿瘤之一，具有高异质性。肝癌的全球发病率正在增加，而且年发病率将快速超过一百万例。肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)占原发性肝癌的90%，主要与丙型肝炎(Hepatitis C virus，HCV)、乙型肝炎(Hepatitis B virus，HBV)、酒精摄取和代谢综合征(如糖尿病、肥胖症)等因素有关。肝癌的发生是一个复杂多步骤的过程，70%~80%的HCC患者都是在既定的风险因素下，发展成肝硬化进展而来的。在HCC的进展过程中，机体细胞中的多基因体细胞突变或表观遗传学修饰改变的共同累积是诱发肿瘤的重要分子驱动，同时也是肝癌异质性差异的主要原因，其关键在于抑癌基因的突变失活或其启动子区的高甲基化修饰，以及原癌基因突变后的过度激活或启动子区的低甲基化修饰。针对肝癌的治疗，目前主要以手术切除、肝移植和药物治疗(如索拉菲尼、瑞格非尼和纳武单抗等)为主，但是肝癌高异质性，术后复发和药物抵抗是影响患者预后的重要风险因素，同时缺乏特异性分子靶向药物和早期筛查诊断标志物。高通量测序技术(High throughput sequencing，HTS)联合生物信息学分析为全面系统分析肿瘤基因组特征提供了有力的手段。系统性地研究肝癌基因组的驱动突变基因和表观遗传学修饰对阐明肝癌驱动发生及恶性化进展极其重要，也对肝癌患者基于其个体基因分型的临床精准治疗有着重要的指导意义。
EYA2是EYA蛋白家族成员之一，具有酪氨酸磷酸酶和转录共激活功能。EYA2在不同类型肿瘤中呈现组织特异性表达，发挥着不同的功能。而EYA2在肝癌中的功能还不清楚。前期我们基于对6例HBV相关肝癌样本的外显子组测序，发现了EYA2新颖的两个突变位点R255K和A510E。经过SIFT和Polyphen位点功能性预测发现，R255K突变没有没有致病性，而A510E突变具有致病性。通过转录和蛋白水平检测证实，与癌旁组织相比，EYA2在人肝癌组织呈低表达。临床资料相关性分析发现，EYA2表达与肝癌临床进展呈负相关性，并可作为肝癌潜在的一个独立预后标志物。癌症体细胞突变目录(The Catalog of Somatic Mutation in Cancer，COSMIC)数据库挖掘发现，EYA2的第510位氨基酸位点的突变也发生在胃腺癌(p.A510V)和恶性黑色素瘤(p.A510A)中。针对前期的研究基础，本课题研究的主要科学问题是EYA2及其突变体A510E在肝癌中的功能，以及EYA2在肝癌中低水平表达的调控机制。
针对此科学问题，本研究具体旨在明确：(1)EYA2及其突变体EYA2(A510E)对肝癌细胞生物学行为的影响与分子机制；(2)EYA2基因表达的DNA甲基化调控；(3)EYA2(A510E)突变体的蛋白降解机制。
本研究分为三部分。
第一部分：EYA2及其突变体EYA2(A510E)对肝癌细胞生物学行为的影响与分子机制
在人肝癌细胞系MHCC-97H和Hep3B细胞中敲减EYA2基因后，肝癌细胞体外的侵袭、迁移、增殖和克隆形成能力和体内裸鼠皮下成瘤能力均较对照组显著增加。在Huh-7细胞中，过表达EYA2抑制肝癌细胞的侵袭、迁移、增殖和克隆形成能力，进一步发现过表达EYA2(A510E)突变体能削弱其抑癌功能，而EYA2(R255K)突变体对肿瘤细胞生物学行为并无显著影响。由于Huh-7细胞在裸鼠体内成瘤性弱，我们分别构建了稳定表达EYA2及其突变体A510E的MHCC-97H细胞系，并进行裸鼠皮下成瘤实验，结果显示EYA2过表达能抑制裸鼠皮下成瘤能力，而EYA2(A510E)突变体则使抑癌功能减弱。通过westernblot检测发现，在肝癌细胞中过表达EYA2，能抑制p-IKB/P65信号通路的活化，激活P27，最终阻止肝癌细胞周期进程和促进细胞凋亡。我们构建了人肝癌裸鼠原位移植模型，评价EYA2对肝癌的基因治疗作用，结果显示裸鼠尾静脉注射2×107TU的EYA2慢病毒，对肝原位肿瘤有良好的抑制作用，肿瘤体积和重量较对照组均显著降低(分别为P=0.0398和P=0.0368)。本部分结果显示：EYA2在肝癌中发挥着抑癌功能，是一种潜在的肝癌抑癌基因。
第二部分：EYA2基因表达的DNA甲基化调控
前期我们分析得到EYA2在肝癌组织样本中的表达低于其癌旁组织。为了进一步解释肝癌中EYA2呈现出的低水平表达，于是我们对30对肝癌及配对癌旁组织提取基因组DNA，分析了EYA2第一个内含子区约411bp片段的甲基化水平。Massarray甲基化质谱分析结果显示，肝癌组织中EYA2第一个内含子区CpG岛的甲基化水平相对于其癌旁组织显著升高(P<0.0001)，并且这种甲基化水平与EYA2mRNA表达呈负相关(r=-0.2975，P=0.021)，该结果用TCGA甲基化数据得到进一步验证。5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine，5-Aza)是一种DNA甲基转移酶抑制剂，能够抑制甲基转移酶的活性，阻止抑癌基因的CpG岛发生甲基化，使DNA异常高甲基化而失活的抑癌基因重新被激活转录。我们使用5-Aza处理四种肝癌细胞系Huh-7、HepG2、Hep3B和MHCC-97H，发现EYA2mRNA表达显著提升。本部分结果显示：EYA2第一个内含子区的高甲基化抑制了EYA2基因的表达。
第三部分：EYA2(A510E)突变体的蛋白降解机制
抑癌基因在基因水平发生失活性突变也提示了其在肝癌样本中处于低水平表达。在第一部分已证实EYA2(A510E)突变减弱了原有的野生型抑癌功能。在这部分我们首先通过荧光实时PCR和Westernblot检测发现，EYA2(A510E)突变后，其转录水平并未降低，但蛋白表达下降。通过生物信息学预测，A510E突变后可能影响EYA2蛋白质的空间折叠。Westernblot证实EYA2(A510E)突变后，引起了未折叠蛋白反应信号通路ATF-6、IRE1α和PERK的活化。进一步我们通过免疫沉淀和免疫荧光的方法证实，EYA2(A510E)突变而表达的未折叠蛋白或错误折叠蛋白主要依赖溶酶体途径和非泛素化蛋白酶体途径而被降解。本部分结果显示：EYA2(A510E)突变激活未折叠蛋白反应，从而依赖于溶酶体降解途径或非泛素化的蛋白酶体降解途径而被降解。
上述结果表明：(1)EYA2具有抑制肝癌细胞恶性表型的功能，而A510E突变体导致抑癌作用消失。(2)EYA2在肝癌中低表达，是由于其第一个内含子区CpG岛的高甲基化导致。(3)EYA2(A510E)突变引起EYA2蛋白翻译水平降解，主要是因为该位点突变引起了未折叠蛋白反应通路的活化，导致其通过溶酶体途径和非泛素化蛋白酶体途径而被降解。本研究丰富了肝癌形成过程中的基因突变遗传学机制和表观遗传学机制，为肝癌靶向治疗提供新靶标、新思路。
EYA2是EYA蛋白家族成员之一，具有酪氨酸磷酸酶和转录共激活功能。EYA2在不同类型肿瘤中呈现组织特异性表达，发挥着不同的功能。而EYA2在肝癌中的功能还不清楚。前期我们基于对6例HBV相关肝癌样本的外显子组测序，发现了EYA2新颖的两个突变位点R255K和A510E。经过SIFT和Polyphen位点功能性预测发现，R255K突变没有没有致病性，而A510E突变具有致病性。通过转录和蛋白水平检测证实，与癌旁组织相比，EYA2在人肝癌组织呈低表达。临床资料相关性分析发现，EYA2表达与肝癌临床进展呈负相关性，并可作为肝癌潜在的一个独立预后标志物。癌症体细胞突变目录(The Catalog of Somatic Mutation in Cancer，COSMIC)数据库挖掘发现，EYA2的第510位氨基酸位点的突变也发生在胃腺癌(p.A510V)和恶性黑色素瘤(p.A510A)中。针对前期的研究基础，本课题研究的主要科学问题是EYA2及其突变体A510E在肝癌中的功能，以及EYA2在肝癌中低水平表达的调控机制。
针对此科学问题，本研究具体旨在明确：(1)EYA2及其突变体EYA2(A510E)对肝癌细胞生物学行为的影响与分子机制；(2)EYA2基因表达的DNA甲基化调控；(3)EYA2(A510E)突变体的蛋白降解机制。
本研究分为三部分。
第一部分：EYA2及其突变体EYA2(A510E)对肝癌细胞生物学行为的影响与分子机制
在人肝癌细胞系MHCC-97H和Hep3B细胞中敲减EYA2基因后，肝癌细胞体外的侵袭、迁移、增殖和克隆形成能力和体内裸鼠皮下成瘤能力均较对照组显著增加。在Huh-7细胞中，过表达EYA2抑制肝癌细胞的侵袭、迁移、增殖和克隆形成能力，进一步发现过表达EYA2(A510E)突变体能削弱其抑癌功能，而EYA2(R255K)突变体对肿瘤细胞生物学行为并无显著影响。由于Huh-7细胞在裸鼠体内成瘤性弱，我们分别构建了稳定表达EYA2及其突变体A510E的MHCC-97H细胞系，并进行裸鼠皮下成瘤实验，结果显示EYA2过表达能抑制裸鼠皮下成瘤能力，而EYA2(A510E)突变体则使抑癌功能减弱。通过westernblot检测发现，在肝癌细胞中过表达EYA2，能抑制p-IKB/P65信号通路的活化，激活P27，最终阻止肝癌细胞周期进程和促进细胞凋亡。我们构建了人肝癌裸鼠原位移植模型，评价EYA2对肝癌的基因治疗作用，结果显示裸鼠尾静脉注射2×107TU的EYA2慢病毒，对肝原位肿瘤有良好的抑制作用，肿瘤体积和重量较对照组均显著降低(分别为P=0.0398和P=0.0368)。本部分结果显示：EYA2在肝癌中发挥着抑癌功能，是一种潜在的肝癌抑癌基因。
第二部分：EYA2基因表达的DNA甲基化调控
前期我们分析得到EYA2在肝癌组织样本中的表达低于其癌旁组织。为了进一步解释肝癌中EYA2呈现出的低水平表达，于是我们对30对肝癌及配对癌旁组织提取基因组DNA，分析了EYA2第一个内含子区约411bp片段的甲基化水平。Massarray甲基化质谱分析结果显示，肝癌组织中EYA2第一个内含子区CpG岛的甲基化水平相对于其癌旁组织显著升高(P<0.0001)，并且这种甲基化水平与EYA2mRNA表达呈负相关(r=-0.2975，P=0.021)，该结果用TCGA甲基化数据得到进一步验证。5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine，5-Aza)是一种DNA甲基转移酶抑制剂，能够抑制甲基转移酶的活性，阻止抑癌基因的CpG岛发生甲基化，使DNA异常高甲基化而失活的抑癌基因重新被激活转录。我们使用5-Aza处理四种肝癌细胞系Huh-7、HepG2、Hep3B和MHCC-97H，发现EYA2mRNA表达显著提升。本部分结果显示：EYA2第一个内含子区的高甲基化抑制了EYA2基因的表达。
第三部分：EYA2(A510E)突变体的蛋白降解机制
抑癌基因在基因水平发生失活性突变也提示了其在肝癌样本中处于低水平表达。在第一部分已证实EYA2(A510E)突变减弱了原有的野生型抑癌功能。在这部分我们首先通过荧光实时PCR和Westernblot检测发现，EYA2(A510E)突变后，其转录水平并未降低，但蛋白表达下降。通过生物信息学预测，A510E突变后可能影响EYA2蛋白质的空间折叠。Westernblot证实EYA2(A510E)突变后，引起了未折叠蛋白反应信号通路ATF-6、IRE1α和PERK的活化。进一步我们通过免疫沉淀和免疫荧光的方法证实，EYA2(A510E)突变而表达的未折叠蛋白或错误折叠蛋白主要依赖溶酶体途径和非泛素化蛋白酶体途径而被降解。本部分结果显示：EYA2(A510E)突变激活未折叠蛋白反应，从而依赖于溶酶体降解途径或非泛素化的蛋白酶体降解途径而被降解。
上述结果表明：(1)EYA2具有抑制肝癌细胞恶性表型的功能，而A510E突变体导致抑癌作用消失。(2)EYA2在肝癌中低表达，是由于其第一个内含子区CpG岛的高甲基化导致。(3)EYA2(A510E)突变引起EYA2蛋白翻译水平降解，主要是因为该位点突变引起了未折叠蛋白反应通路的活化，导致其通过溶酶体途径和非泛素化蛋白酶体途径而被降解。本研究丰富了肝癌形成过程中的基因突变遗传学机制和表观遗传学机制，为肝癌靶向治疗提供新靶标、新思路。