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黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFs）是由黄曲霉（Aspergilus flavus）与寄生曲霉（Aspergilus parasiticus）等真菌产生的一种剧毒代谢产物,作为天然污染物广泛存在于农产品和食品中,严重威胁人类和动物健康,并造成巨大经济损失。随着世界范围内对黄曲霉毒素的日益关注,发展可靠的黄曲霉毒素检测技术已成为当前亟需解决的问题。基于抗体和抗原之间特异性结合反应的免疫分析法具有通量高、特异性好、简单快速等特点,已成为快速筛查真菌毒素的常用方法。纳米抗体是最小的抗原结合片段,与常规抗体相比,具有极强稳定性、高溶解性和易于进行基因工程改造等性质,在小分子污染物的快速免疫分析中具有广泛的应用前景。为了提高基于纳米抗体免疫分析法的灵敏度和检测效率,本研究以抗AFB1纳米抗体Nb26为实验材料,采用基因重组技术制备纳米抗体融合蛋白,同时引入不同信号放大技术进行研究,为纳米抗体在免疫检测中的广泛应用提供新思路。本论文的主要研究内容和研究结果如下:1.基于生物素化纳米抗体的免疫分析方法研究。选择2种间隔臂长的生物素分子通过化学偶联法得到八种生物素化纳米抗体Nb26,经BA-ELISA（Biotin-streptavidin-amplified enzyme-linked immunosorbent assay）分析,选择Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin与纳米抗体Nb26以10:1摩尔比制备生物素化纳米抗体Nb26。选择SA-HRP和SA-PolyHRP作为“检测示踪物”,结果发现SA-PolyHRP以1:10000稀释倍数进行BA-ELISA能提高灵敏度并降低抗原抗体用量。以生物素化纳米抗体Nb26为检测一抗,以SA-PolyHRP为信号放大器,建立了检测小麦和玉米样品中AFB1的BA-ELISA,该方法的灵敏度（IC50值）为0.21 ng/mL,线性范围为0.08-0.65 ng/mL,检测限为0.04 ng/mL,与传统的基于Nb26的ELISA方法相比,抗体用量减少了近2个数量级。样品加标回收率在87.35%-98.53%之间,变异系数在5.23%-10.77%之间,表明该方法具有良好的准确性和可靠性。2.定点生物素化纳米抗体融合蛋白的制备及免疫检测方法建立。将Nb26基因与AviTag基因进行基因重组并克隆至表达载体pET32m中,构建了四种融合表达载体pET32m-AviTag-Nb26,分别转化至E.coli BL21（DE3）中进行原核表达。对AviTag-Nb26融合蛋白活性进行分析,选择AviTag-Nb26-His融合蛋白建立了快速检测农产品中AFB1的含量的BA-ELISA,该方法的灵敏度为0.28 ng/mL,线性范围为0.12-0.95 ng/mL,检测限为0.07 ng/mL,对AFB1具有良好特异性。样品加标回收率在91.06%-96.70%之间,变异系数在4.96%-9.47%之间,表明该方法具有良好的准确性和可靠性。3.基于免疫磁珠和生物素-链霉亲和素的免疫分析方法建立。以AviTag-Nb26-His融合蛋白为检测一抗,将完全抗原AFB1-BSA直接固定在羧基化免疫磁珠表面上合成抗原探针MB-AFB1-BSA,结合生物素-链霉亲和素放大系统建立了免疫检测方法MB-ELISA（Magnetic bead-based ELISA）,该方法的灵敏度为0.53 ng/mL,线性范围为0.21-1.37 ng/mL,检测限为0.12 ng/mL,对AFB1具有良好特异性,检测时间由传统ELISA方法所需的2 h缩短至26 min。样品加标回收率在90.10%-97.25%之间,变异系数在4.03%-10.55%之间,表明该方法具有良好的准确性和可靠性。4.纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的制备及一步法化学发光酶免疫分析方法建立。将Nb26基因与碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AP）基因基因重组并克隆至表达载体pET32m中,构建了四种重组融合表达载体pET32m-AP-Nb26,分别转化至E.coli BL21（DE3）中进行原核表达,经纯化获得四种AP-Nb26融合蛋白,均具有识别AFB1的活性和碱性磷酸酶的活性。通过比较比色分析法和化学发光分析法,选择AP-G4S-Nb26融合蛋白为检测抗体,采用化学发光分析法建立了检测小麦和玉米样品中AFB1的一步法CLEIA（Chemiluminescent enzyme immunoassay）,该方法的灵敏度为0.25 ng/mL,线性范围为0.09-0.81 ng/mL,检测限为0.05 ng/mL,对AFB1具有良好特异性。样品加标回收率在89.83%-99.05%之间,变异系数在4.78%-9.04%之间,表明该方法具有良好的准确性和可靠性。综上所述,本研究基于抗AFB1纳米抗体Nb26研发了一系列快速检测AFB1的免疫分析法,提高了基于纳米抗体免疫分析法的灵敏度和检测效率。本文研究成果为农产品中黄曲霉毒素污染的及时检测提供了分析方法,同时对农产品中低浓度污染物检测技术的开发具有重要指导价值。