论文部分内容阅读
细胞周期是细胞生命活动的基本过程,也是生物体生长发育的基础。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）信号通路是丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPK）信号转导通路的重要分支之一,能将细胞外的刺激信号转导到细胞及其核内,对于维持细胞周期的正常运行具有重要的作用。其中,原癌基因Jun（Jun proto-oncogene）作为JNK信号通路的下游关键靶基因,可以选择性地抑制或激活细胞周期蛋白和细胞周期依赖性激酶的转录,从而参与细胞周期的调控。对JNK信号通路及相关基因Jun的功能研究有利于完善细胞周期的调控机制。家蚕（Bombyx mori）作为鳞翅目昆虫的重要模式动物,其体内进行的细胞周期形式具有组织差异性,既有进行有丝分裂的卵巢等组织,也有进行核内复制的丝腺组织,是解析细胞周期调控机制的良好研究对象。因此,本研究以JNK信号通路及其下游关键基因BmJun为切入点,通过抑制剂SP600125阻断JNK信号通路,分析了JNK信号通路对家蚕有丝分裂和丝腺细胞核内复制的调控作用,最后对BmJun基因在家蚕细胞周期中的相关功能进行研究,可为阐明家蚕细胞周期的调控机制提供新的依据,也可为蚕丝改良提供理论支撑。获得的主要研究结果和结论如下:1.JNK信号通路对家蚕细胞周期的影响SP600125作为JNK的磷酸化抑制剂,常用于JNK信号途径的研究。为了分析JNK信号通路对家蚕正常细胞周期和丝腺组织核内复制的影响。本研究首先在Bm N-SWU1细胞中添加JNK蛋白的抑制剂SP600125,实时荧光定量PCR（q RT-PCR）分析显示JNK信号通路中的下游成员BmJun基因的表达量下调;CCK-8、流式细胞术和Ed U的实验结果表明,添加SP600125后能够抑制细胞的增殖,使细胞周期逐渐阻滞在G2/M期,并且DNA的合成速率增强;通过体外添加和体内注射SP600125,对四龄一天的家蚕丝腺细胞DNA复制情况进行统计,Ed U实验结果显示无论是体外添加还是体内注射,均能够提高丝腺细胞的DNA合成速率。同时分析了抑制剂SP600125对丝腺核内复制的影响,q RT-PCR结果显示体外添加和体内注射抑制剂SP600125后,JNK信号通路中下游靶基因成员BmJun表达量下调,与DNA复制相关的周期基因Bm CDK2、Bm Cyclin A和Bm Cyclin E表达量上调。以上结果说明SP600125处理家蚕细胞后,能够抑制下游成员BmJun基因的表达,导致家蚕细胞周期发生变化,暗示着BmJun基因在JNK信号通路调控家蚕细胞周期的过程中发挥着极为重要的作用。2.BmJun基因调控Bm N-SWU1细胞周期的研究为了进一步分析BmJun基因在家蚕细胞周期调控中的功能,本研究首先对BmJun基因的序列进行分析,通过家蚕Silk DB 3.0和NCBI数据库比对得到BmJun基因的CDS序列长度为720 bp,编码240个氨基酸。利用在线工具SMART对BmJun蛋白进行结构域预测,发现BmJun蛋白含有一个与DNA结合的碱性结构域BRLZ。免疫荧光实验发现BmJun蛋白定位于细胞核。通过构建BmJun的过表达载体和干涉载体,探究BmJun基因对Bm N-SWU1细胞周期的调控作用。CCK-8、流式细胞术和Ed U的实验结果表明过表达BmJun基因抑制细胞的增殖,使细胞周期阻滞在G0/G1期并抑制DNA的复制;干涉BmJun基因能够促进细胞的增殖,使细胞周期阻滞在G2/M期,并且DNA的合成能力增强。以上结果说明BmJun基因可能以负调节方式参与家蚕细胞周期的调控。3.BmJun基因调控家蚕丝腺细胞核内复制的研究为了探究BmJun基因对家蚕丝腺细胞核内复制的调控作用,本研究分析了BmJun基因在丝腺组织各时期的表达模式,结果显示BmJun基因在DNA合成旺盛的五龄丝腺组织中表达量相对比较低;通过家蚕转基因显微注射技术创制了家蚕丝腺特异性敲除BmJun转基因品系,并命名为Ser1P-BmJun-KO品系。在该品系不同组织中检测Cas9和BmJun的表达情况,发现Ser1P-BmJun-KO品系成功在中部丝腺部位敲除BmJun基因;随后对Ser1P-BmJun-KO品系的表型进行系统性分析,结果显示Ser1P-BmJun-KO品系的幼虫大小与对照大造品系无差异变化,蚕茧品质分析结果显示,Ser1P-BmJun-KO品系的全茧重和茧层重都高于对照品系,蛹重无明显变化,蚕茧率高于对照品系;通过扫描电镜观察到Ser1P-BmJun-KO品系蚕茧的横切面厚度厚于对照品系,蚕茧的外表面和内表面相对对照品系排布紊乱,缫丝后发现Ser1P-BmJun-KO品系茧丝的直径大于对照品系。进一步对中部丝腺组织的变化进行分析,结果显示Ser1P-BmJun-KO品系中部丝腺的重量、大小、长度、直径和横截面面积都要大于对照品系;利用Ed U标记和鬼笔环肽标记技术,分析Ser1P-BmJun-KO品系丝腺细胞的变化情况,结果显示Ser1P-BmJun-KO品系丝腺细胞的细胞数目与对照品系相比无差异变化,但细胞大小出现不均一的现象,检测发现DNA合成时期即S期的蛋白激酶复合物Cyclin A、Cyclin E和CDK2的表达量上调,进而DNA的复制能力增强,Ser1P-BmJun-KO品系中部丝腺的总DNA重量重于对照品系。以上表明BmJun基因可能依赖于S期的蛋白激酶复合物参与调控家蚕丝腺细胞的核内复制。