蜘蛛牵丝是构成蜘蛛网的框架丝,是目前已知强度最高的天然蛋白质丝,能够与市售制造防弹衣的人工合成纤维相媲美.它由牵丝Ⅰ型和牵丝Ⅱ型蛋白按3:2的比例构成,这两种蛋白质丝在结构上存在许多相似之处,其N端均为串联重复结构,包括由多聚丙氨酸构成的β折叠结构和由其它氨基酸构成的α螺旋与β转角结构,C端含有约100多个氨基酸组成的非重复区.各串联重复区之间以及其与非重复结构区间无其它散在元件.研究表明牵丝的强度主要取决于β折叠结构,而弹性则主要来源于α螺旋和β转角结构.现推测牵丝Ⅰ型蛋白较牵丝Ⅱ型蛋白具有更高强度.该工作以1990年Xu等人报道的金纺者牵丝Ⅰ型蛋白基因序列为基础,通过RNA二级结构分析确立使其结构能级达到较低的密码子,分别合成含有三组多聚丙氨酸的牵丝Ⅰ型蛋白部分重复区序列(单体)及其3端非重复区多肽基因,并在第三组多聚丙氨酸结构中增加或减少一个丙氨酸,得到三种不同的单体基因.再经过酶切、连接分别获得重复区为2、4、8、16拷贝的聚合体,并将它们与3端非重复区基因连接获得15种牵丝Ⅰ型蛋白基因类似物.序列比对显示;合成基因八聚体与报道基因所编码氨基酸同源性高达84﹪,二者具有类似mRNA二级结构.另根据重复区基因编码的多肽序列合成含有α螺旋和β-转角结构的半抗原短肽(17AA),通过MBS与抗原KLH连接,连接产物经乳化后免疫成年在雄性新西兰大耳白兔和20g以上雄性Bab/c小鼠,每两周免疫一次,共免疫5次,得到效价为64×10<4>的兔抗血清及效价为1.0×10<4>的鼠抗血清,用于检测合成基因的表达.将上述不含非重复区序列的2、4、8聚合体分别克隆大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导后,表达菌体总蛋白的SDS-PAGA电泳检测未见明显特异表达带,Western-blot显示无特异带.但采用利福平阻断菌体基因表达,并在培养基中添加<35>S-Met,通过放射自显影可见由T7启动子起始的特异目的基因表达带.将含有非重复区序列的三种二聚体和三种四聚体克隆真核表达载体,分别转染CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、293T(SV40大T抗原转化的人胚肾细胞)、NBK(新生牛肾细胞)及CV-1(猴肾细胞)系,RT-PCR检测表明具有特异mRNA转录,间接免疫荧光显示目的基因在真核细胞中获得表达,且表达产物趋向于分布在细胞膜上.转染细胞经Zeocine抗性筛选及多次稀释培养,获得稳定表达目的基因的纯系CHO细胞克隆.