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[目 的]探究低强度2.4GHz RF-EMF对APP/PS1小鼠发病和病程的影响,研究RF-EMF暴露与PGC1α基因和ROS的交互作用,为了解RF-EMF对小鼠认知功能的影响提供实验证据。[方法]本研究使用野生型C57小鼠、APP/PS1双转基因AD小鼠作为动物模型暴露于2.4 GHz射频电磁场。采用水迷宫测试小鼠认知功能,HE染色及透射电镜分别观察小鼠海马组织结构、海马线粒体超微结构,ELISA检测血清中Aβ1-40和Aβ1-42的含量,使用qPCR、WB或脑组织切片染色等测量小鼠海马中Aβ、NMDAR、Mcu、Nclx、CaM、Cn、Bad、p-Bad、CytC 和 Caspase3 等含量。为探测RF-EMF暴露及PGC1α基因过表达后对海马神经元的影响,本课题采用Aβ1-42多肽诱导后的HT22细胞作为AD细胞模型。CCK-8计算Aβ1-42多肽及RF-EMF暴露导致HT22细胞凋亡的IC50;JC-1检测HT22细胞线粒体膜电位强度;化学发光法检测ATP和ROS;PCR检测线粒体基因mtDNA拷贝数;MitoTracker Red CMXRos荧光染色法测量线粒体密度;qPCR和WB检测Aβ-Ca2+-线粒体通路相关基因的表达。为进一步探究RF-EMF与PGC1α基因和ROS的交互作用及其对HT22细胞线粒体质量的影响。用H2O2作阳性对照,探测RF-EMF对HT22细胞的氧化应激作用,流式细胞法检测细胞凋亡,使用WB检测PGC1α、CaM、CytC和p-Bad蛋白的表达。腺相关病毒法原位过表达小鼠海马的PGC1α基因,验证PGC1α与RF-EMF暴露对AD小鼠认知功能的影响。[结果]本实验条件下:1.共鉴定370只繁殖幼鼠,其中APP/PS1双转基因鼠169只,野生型126只,淘汰其余75只单转基因鼠。一月龄转基因AD小鼠和野生型小鼠的水迷宫成绩无统计学差异(P>0.05)。ELISA结果显示:RF-EMF降低血清中难溶Aβ的含量(P<0.05)。HE结果显示:AD RF组小鼠CA1神经元细胞紊乱,细胞核出现皱缩、空洞等现象。电镜结果显示:RF-EMF暴露增加了 AD小鼠海马细胞线粒体的损伤。2.小鼠海马相关基因mRNA的相对表达量结果四月龄,WT Sham 组(P<0.05)和 AD RF 组(P<0.01)的 Grin1 表达量低于 WT Control 组;AD Sham 和 AD RF 组 Grin2a 表达量低于 WT Control 组(P<0.05),AD RF 组低于 AD Control 组(P<0.01);AD RF 组 Mcu 表达量低于AD Control 组(P<0.01);AD RF 组的 Nclx 表达量低于 AD Control 组。九月龄,AD RF组Grin1表达量低于其它组(P<0.01),WT RF组高于WT Control 组(P<0.05);AD Control 组 Grin2a 表达量高于 WT Control 组(P<0.001),且高于AD RF组(P<0.01);WTRF组的Grin2b表达量高于其它组(P<0.01);WT RF 组 PGC1α 表达量高于 AD RF 组(P<0.01);AD Control 组Mcu表达量高于WT Control组(P<0.05),WT RF高于其它组(P<0.01);AD RF组Nclx表达量高于其它组(P<0.001)。小鼠海马相关蛋白结果四月龄,PGC1α蛋白含量:AD control组表达量低于WT Control组,AD RF和WT RF组高于分别对应的Sham组和Control组;Cam蛋白含量:AD RF和AD Sham组低于其它组;Mfn2蛋白含量:AD RF组含量低于其它组;Cox1蛋白含量:各AD组均低于对应的WT组,且AD和WT的RF低于对应的Control组;Cox3蛋白含量:各AD组均低于对应的WT组;Cytc蛋白含量:各AD组均低于对应的WT组;Bad蛋白含量:AD Control组低于WT Control组,AD RF和WT RF组分别低于各自对应的Control组;磷酸化Bad蛋白含量:AD RF组高于其它组;Casepase3蛋白含量:AD control组表达量高于WTControl组,AD RF组低于AD control组;内参蛋白β-actin蛋白含量和Tubilin蛋白含量各组无差异。九月龄,PGC1α蛋白含量:AD control组+AD Sham组的表达量低于WT Control组+WT Sham组,AD RF组的表达量低于WT RF组,AD RF组低于AD Control组;Cam蛋白含量:AD RF组低于其它组,AD组低于对应的WT组;Nclx蛋白含量:AD RF组高于其它组;Drp1蛋白含量:AD组低于对应的WT组,AD RF和WT RF组低于各自对应的Control;Fis1蛋白含量:AD control表达量低于WT Control组,但AD RF组高于WT RF组;Mfn2蛋白含量:AD RF和WT RF组低于各自对应的Control;Cox1蛋白含量:AD Control组表达量高于WT Control 组,AD RF 组低于 AD Control 组,WT RF 组高于 WT Control 组;Cytc蛋白含量:AD组低于对应的WT组,AD RF和WTRF组低于各自对应的Control;Bad蛋白含量:AD RF组低于其它组,AD组低于对应的WT组;磷酸化Bad蛋白含量:AD Control组高于WT Control组;Casepase3蛋白含量:AD Control组高于WT Control组,AD RF和WT RF组低于各自对应的Control;内参蛋白Tubilin蛋白含量和β-actin蛋白含量各组无差异。AD小鼠海马线粒体钙含量显著高于WT小鼠(P<0.01)。30.00μg/mL Aβ1-42多肽处理细胞24h,细胞活性减少50%左右。发现先加Aβ随后RF-EMF暴露24h细胞活性低于先暴露24h后加Aβ多肽,当细胞过表达PGC1α 后,IC50=47.88μg/mL。较空白对照的 IC50A=3 1.35μg/mL 和单一的 RF-EMF暴露之后的IC50B=36.55μg/mL均有提高;PGC1α过表达显著降低了细胞的凋亡率(P<0.01)。相比对照组,过表达PGC1α组、RF组和两者叠加组ATP表达升高(P<0.05)。HT22细胞在加Aβ多肽后线粒体膜电位强度显著下降,PGC1α过表达能提高细胞线粒体膜电位。细胞内ROS含量在经RF-EMF暴露0h、6h、和12h后,呈现上升趋势;12h和24h的ROS含量没有增加;较Aβ组,RF+Aβ组的胞内ROS含量降低。且PGC1α质粒转染成功后再加Aβ,ROS显著降低(<0.05)。与Control组比较,Aβ多肽组线粒体密度下降,过表达PGC1α组、RF组和两者叠加组增加了线粒体密度,与ATP含量变化一致。3.HT22细胞相关蛋白结果Aβ1-42降低了 Mcu、Mnf2蛋白的表达,增加了 Fis1、Bad、磷酸化Bad、Cytc和Caspase3的表达(P<0.05)。PGC1α质粒转染后,增加了 PGC1α蛋白的表达量,降低了 Nclx和线粒体分裂蛋白Fis1的表达;抵消Aβ降低的Mcu,抵消了 Aβ增加的Fis1、Bad、磷酸化Bad和Caspase3。在叠加RF后,降低了本来表达上升的PGC1α、Mcu;反而增加了因PGC1α质粒转染后降低的Nclx、Bad、磷酸化Bad和Caspase3。此外,PGC1α过表达并未降低Aβ1-42引起的Cytc升高,而RF-EMF的暴露再次增加了 Cytc的表达。PGC1α质粒转染后明显降低了 Aβ对线粒体的损伤。较Control+Aβ组,200μM H2O2处理细胞12h后,少量增加了 PGC1α,但降低了 Cytc,H2O2+PGC1α+Aβ 较 PGC1α+Aβ,进一步降低了磷酸化的Bad蛋白含量。小鼠过表达PGC1α及RF-EMF暴露后小鼠水迷宫结果显示:九月龄AD+阴性+Control组小鼠的TPL与EL成绩显著低于其它组。AD+阴性+Sham组的EL:Day1-Day2差值结果显示低于其它AD组。小鼠海马相关蛋白结果显示,AAV干预增加了 WT和AD小鼠海马的PGC1α,AAV叠加RF增加了 WT和AD小鼠海马的PGC1α和Mcu。AAV降低了 WT小鼠海马的Cam、Bcl-2和Caspase3蛋白的表达,AAV增加了 Opa1蛋白的表达;AAV叠加RF降低了 AD小鼠海马Bcl-2蛋白的表达。九月龄小鼠海马Aβ1-42免疫组化结果显示,较野生C57,AD小鼠海马Aβ斑块明显;较AD Control组,AD小鼠在接受RF-EMF暴露三个月后,海马Aβ斑块显著减少。[结 论]1.AD小鼠认知功能水平低于野生型小鼠。RF-EMF暴露对未发病APP/PS1小鼠的学习能力有益,延缓了 APP/PS1小鼠的海马神经元紊乱发生。2.AD小鼠神经元产生过量ROS,降低线粒体发生,破坏分裂融合的动态平衡,减少ATP产生;进一步增加ROS,降低ΔΨm,导致神经元凋亡。PGC1α过表达一定程度上减轻了 Aβ对神经元的损伤。3.RF-EMF暴露增加了小鼠神经元胞内的ROS含量,使细胞提前接受氧化应激,提高PGC1α的表达,促进线粒体的发生,进而负反馈抑制ROS的产生;若先加Aβ模拟神经元的AD损伤,后进行RF-EMF暴露,会进一步增加ROS的含量,加重神经元损伤,导致认知功能下降。总之,低强度RF-EMF对正常小鼠和未发病APP/PS1小鼠的认知功能有一定的保护作用,加重AD小鼠的认知功能损伤,但两者的界限本课题没有深入讨论,有待进一步研究。