丝状真菌是一类重要的真菌类群,在陆地、海洋、空气及土壤中广泛分布,具有重要的分类地位和研究价值。丝状真菌大部分属种进行无性繁殖,极少数种具有有性态。该类真菌的进化和有性发育往往会受到多种基因的控制,如交配型基因、信息素和G蛋白基因等。新西兰匍柄霉（Stemphylium eturmiunum）作为匍柄霉属（Stemphylium）的典型代表种,是匍柄霉属中少数能产生有性态的物种之一,这就为研究丝状真菌的有性生殖发育机制提供了重要的研究材料。组蛋白分子伴侣ASF1是一种从酵母到哺乳动物高度保守的组蛋白H3/H4的分子伴侣,它能参与调控核小体组装与解聚和正常细胞周期等过程;同时,在组蛋白修饰、配子发生、DNA复制和损伤修复等方面发挥着重要作用。然而,在无性丝状真菌中对ASF1的研究较少。本研究以ASF1为研究对象,在S.eturmiunum中如何调控有性和无性生长发育的机制进行深入探究。本研究将以S.eturmiunum野生型作为实验材料,通过全基因组测序首次确定组蛋白分子伴侣ASF1并成功克隆。将ASF1氨基酸序列与植物、动物和真菌中ASF1的氨基酸序列比对分析,S.eturmiunum asf1与番茄匍柄霉（S.lycopersici）asf1同源性最高,进化关系最近;所有物种的ASF1氨基酸序列的N端前155个氨基酸相对保守,并且含有ASF1 hist chap superfamily保守功能域,然而C端呈现出多样性。通过农杆菌介导的真菌遗传转化体系,对Seasf1进行敲除和回补实验。在本研究中,S.eturmiunum野生型菌株菌丝生长茂盛,三周左右长出成熟的分生孢子,五周左右产生子囊和子囊孢子,菌丝DAPI染色显示细胞核分布均匀。然而,?asf1菌丝的生长速率降低,菌丝融合较为普遍,不再产生子囊壳和子囊孢子,表现出不育症状;?asf1的分生孢子由椭圆形发育为不规则的形状,着生方式变为间生,分生孢子的隔膜数减少,大多为团生,单个孢子变大;?asf1的菌丝细胞核分布变化较大,某些部位较为集中。随后,对asf1回补转化子表型观察发现,回补转化子菌落生长速率、菌丝生长情况与野生型菌株基本一致;回补转化子的分生孢子和子囊孢子基本恢复野生型的表型;DAPI染色显示细胞核分布均匀,与野生型基本一致。证实了S.eturmiunum中组蛋白分子伴侣ASF1能调控菌丝生长以及有性和无性生殖发育。为进一步揭示S.eturmiunum中组蛋白分子伴侣ASF1调控有性和无性发育的机制,对野生型菌丝生长时期,野生型有性发育时期和?asf1突变体进行转录组测序分析发现,?asf1与野生型有性发育时期共有3716个差异表达的基因,其中有2342个基因上调表达,1374个基因下调表达;?asf1与野生型菌丝生长时期共有3023个差异表达基因,其中有1719个基因上调表达,1304个基因下调表达;野生型菌丝生长时期和有性发育时期共有3094个差异表达基因,其中有1343个基因上调表达,1751个基因下调表达。通过对这些差异表达基因GO富集分析发现,许多基因参与了S.eturmiunum的细胞进程、次级生长代谢、细胞器活性和催化活性等,如尿囊酸透性酶（Se10206）、基序保守域蛋白（Se03485）、囊泡外壳复合物COPII（Se07693）和DJ-1（Se02026）。随后,利用RNAi方法对这4个基因分别进行沉默后,每个基因的沉默转化子沉默效率都在75%以上,对沉默转化子的表型观察发现,Se03485、Se07693和Se10206这3个基因沉默后对S.eturmiunum有性和无性发育没有影响;然而,DJ-1基因沉默转化子表型发生了明显的变化,分生孢子和分生孢子梗生长缓慢且变得畸形,不产生子囊壳,这表明DJ-1基因可能协同ASF1在调控S.eturmiunum有性生殖和无性发育过程中起到至关重要的作用。对DJ-1基因进一步研究发现,DJ-1是PI3K/AKT信号通路的上游的重要组分,在哺乳动物中参与调控多种生物学功能。通过在转录水平和蛋白水平,利用酵母双杂交实验、Pull down和Co-IP实验研究发现,在?asf1突变体中,Sedj-1下调表达,Se H4上调表达;在Se H4沉默转化子中,Sedj-1下调表达,Seasf1上调表达;在Sedj-1沉默转化子中,Seasf1和Se H4都下调表达。Se ASF1、Se H4和Se DJ-1三者相互作用,并且检测通路下游蛋白Se GSK3在Sedj-1沉默转化子和Sepi3k沉默转化子中均上调表达,而Se PI3K和Se DJ-1在Sedj-1沉默转化子中都是下调表达。这表明在S.eturmiunum中,Se DJ-1也是位于PI3K/AKT信号通路上游,并且Se DJ-1与Se PI3K和Se GSK3相互作用。为进一步探究Se DJ-1在PI3K/AKT信号通路是如何调控S.eturmiunum的有性和无性发育,通过基因沉默实验,Sepi3k沉默转化子能产生子囊壳,但是没有子囊和子囊孢子,而对分生孢子的产生没有影响。同时,过表达实验发现,Sepi3k在Sedj-1沉默转化子中过表达后,Sedj-1沉默转化子可以恢复有性发育的特征;在Sepi3k沉默转化子中过表达Sedj-1,Sepi3k沉默转化同样可以恢复有性发育的特征。这表明Se DJ-1和Se PI3K不仅是PI3K/AKT信号通路的两个重要成员,而且在调控S.eturmiunum有性发育过程中发挥同样的功能。为了进一步阐明Se DJ-1调节有性发育的机制,将Se DJ-1截短,并获得7个截短体。通过酵母双杂交实验和Co-IP实验证明Se DJ-1-M6作为Se DJ-1与Se PI3K相互作用的关键区域。将Se DJ-1-M6在Sepi3k沉默转化子中过表达,Sepi3k沉默转化子恢复了有性型特征,证明Se DJ-1-M6也是调控有性发育的关键功能区域。综上所述,在S.eturmiunum中,ASF1作为组蛋白H4的分子伴侣,能与DJ-1相互作用,并且参与PI3K/AKT信号通路调控有性和无性发育。具体调控机制如下:Se ASF1与Se H4相互作用,通过核孔进入细胞核,Se ASF1-Se H4异源二聚体与Se DJ-1相互作用并结合形成一个新的异源三聚体,调控有性和无性发育;随后,Se DJ-1参与PI3K/AKT信号通路激发Se PI3K调控有性生长发育。因此,Se ASF1可以激活PI3K/AKT信号通路调节有性和无性发育。