FOXO3a在胃肠间质瘤增殖及凋亡中作用的研究

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目的:胃肠间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor,GIST)是消化道最常见的间叶源性肿瘤。叉头框蛋白O亚家族3a(Forkhead box O3a,FOXO3a)作为转录调节因子,在细胞增殖、凋亡、应激、分化等过程中起着重要作用。本研究拟观察FOXO3a在GIST组织中的表达,并从体外水平初步研究FOXO3a对GIST-T1细胞增殖及凋亡的影响,为治疗GIST寻找新靶点提供新线索。方法:1.采用免疫组织化学法检测32例石蜡包埋的GIST及其正常组织中FOXO3a蛋白的表达水平,并探讨其与GIST的相关性。入组标准为2010年于本院首次接受GIST手术治疗并且术前未经靶向治疗及放、化疗等的GIST患者的肿瘤石蜡组织及其正常组织;2.运用重叠延伸PCR和酶切、酶连技术构建过表达FOXO3a质粒;3.使用电穿孔法将已构建好的过表达FOXO3a的质粒转染入GIST-T1细胞,24-48h后在荧光倒置显微镜下观察并用Western blot方法评估转染效果;4.通过CCK-8法观察FOXO3a对GIST-T1细胞增殖的影响;5.通过流式细胞术(PI法)检测细胞周期及细胞晚期凋亡;6.通过Western blot方法观察FOXO3a对部分细胞凋亡及细胞周期相关蛋白水平的影响。结果:1.FOXO3a蛋白在GIST组织中的表达较其正常组织降低(P<0.05);2.成功构建过表达FOXO3a质粒,并经双酶切及测序比对验证;3.在120μl电转体系(GIST-T1细胞数2×106、质粒浓度1μg/μl以上、20μg)在电压570V、时间30ms、电击1次或者20μl电转体系(GIST-T1细胞数1.5×105、质粒浓度1μg/μl以上、3μg)在电压360V、时间30ms、电击1次条件下可以取得相对较满意的转染效率(存活下来的细胞转染成功率>70%),且过表达FOXO3a组的FOXO3a蛋白表达水平高于其电转空载体组(P<0.05);4.过表达FOXO3a可使GIST-T1细胞增殖能力减弱(P<0.05);5.过表达FOXO3a组的GIST-T1细胞晚期凋亡多于对照组(P<0.05),其余各细胞周期无明显差异(P>0.05);6.过表达FOXO3a的GIST-T1细胞的Bim、p27kip1、cleaved PARP蛋白表达水平上升,cyclin D1蛋白表达水平下降。结论:1.FOXO3a的表达水平在GIST组织中降低;2.FOXO3a可以抑制GIST-T1细胞的增殖能力,并促进它的凋亡;3、FOXO3a可能在GIST中扮演肿瘤抑制者的角色。
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