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微孢子虫是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,在自然界中有广泛的寄主,具有种属多样性。其中导致家蚕微粒子病的主要病原家蚕微孢子虫Nosema bombycis,给蚕业生产带来了毁灭性的灾害。目前其检测方法有显微镜检法、免疫学诊断法、PCR法及核酸杂交法等,但难以快速、准确、简便的检测其种属特异性。因此,开展对家蚕病原微孢子虫的检测技术研究,从而建立一种快速、特异、简单方便的检测技术,具有重要意义。本研究在收集、分离纯化家蚕微孢子虫及蚕种生产上的母蛾镜检样品的基础上,基于家蚕微孢子虫拟假基因,设计筛选了适合检测家蚕典型病原微孢子虫种N.bombycis的特异LAMP引物,进而对引物的特异性、灵敏度及对生产样品的实用性等,进行了检测探讨。获得的主要结果如下:
(1)基于N.b基因组的16S rDNA的一段拟假基因序列,建立了一种快速、特异、简便的检测N.b的方法-LAMP法,反应产物检测经过显色即可通过肉眼判断。
(2)利用LAMP引物设计软件PrimerExplorer V3,根据源于N.bombycis小亚基RNA的一段拟假基因序列,依据LAMP引物设计规则,设计合成出6组引物,对这些引物的有效性、特异性、反应时间等进行了初步探讨,找出了一组能快速、特异的检测出N.bombycis的引物组:FI2/BI2,F2/B2。
(3)应用引物组FI2/BI2,F2/B2对微孢子虫的种属特异性进行LAMP法检测时发现,该组引物能检测出N.b、N.b+NPV的混合液、斜纹夜蛾孢子,且LAMP法和PCR法检测结果相符,推测N.b和斜纹夜蛾孢子可能属于相同的种。
(4) LAMP法检测家蚕微孢子虫灵敏度时发现,LAMP法对煮沸沉淀法抽提的DNA比用CTAB法抽提的DNA敏感性高104倍,比PCR法高100倍,能检测到浓度为3.6×103个孢子/mL的家蚕微孢子虫。用CTAB法抽提DNA时,LAMP法灵敏度比PCR法低10倍,检测限为3.6×107个孢子/mL的家蚕微孢子虫;在检测N.b DNA模板浓度灵敏度时,用CTAB法抽提DNA时,LAMP法与PCR法敏感性一致,只能检测原始浓度的模板DNA;而用煮沸沉淀法时,LAMP法比PCR法高10倍,能检测到10-3倍N.b DNA。
(5)在检测模拟生产样品时,LAMP法在家蚕感染N.b的第1d即能检测出,与PCR法检测结果相符;在检测生产上母蛾镜检的类似样品时,检出率较低,LAMP法检出率为0,而PCR法为1/16,因此在实用性方面,还需要进一步摸索。
(6)在检测种属特异性及生产样品时,在加入Bst酶前,进行预变性的方法,一定程度上能减少假阳性的产生。