【摘 要】
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铁作为水稻最重要的营养元素之一,参与细胞的多种生理生化过程。而水稻作为我国的主要粮食作物,被广泛种植,但由于水稻种植土壤环境不同,有很大一部分水稻正在面临直接或间接的缺铁胁迫,如在盐碱地中由于p H较高,土壤中离子态的铁元素很少,且多以Fe3+存在,严重影响水稻的正常生长和代谢。Os IDEF1在水稻在缺铁条件下表达量升高,该转录因子能够识别下游的顺式作用元件IDE1,并诱导下游基因的表达。通过研
【出 处】
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中国科学院大学(中国科学院东北地理与农业生态研究所)
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铁作为水稻最重要的营养元素之一,参与细胞的多种生理生化过程。而水稻作为我国的主要粮食作物,被广泛种植,但由于水稻种植土壤环境不同,有很大一部分水稻正在面临直接或间接的缺铁胁迫,如在盐碱地中由于p H较高,土壤中离子态的铁元素很少,且多以Fe3+存在,严重影响水稻的正常生长和代谢。Os IDEF1在水稻在缺铁条件下表达量升高,该转录因子能够识别下游的顺式作用元件IDE1,并诱导下游基因的表达。通过研究Os IDEF1可深度挖掘水稻在缺铁胁迫下的分子机制,为解决其在盐碱等条件下导致的缺铁问题提供理论依据。已有研究表明,Os IDEF1具有三种不同单倍型,包括最短的吉粳88（J88）型、次之的长白9（C9）型和最长的IR64型,这三种单倍型基因长度依次相差12 bp,蛋白序列相差4个氨基酸。通过对蛋白结构分析发现其变异位点主要存在于与二价金属离子结合的HN区,因此在此位点发生的变异是否影响了该基因的功能呢?本研究通过构建转基因材料和代换系群体,对其进行表型分析,鉴定不同单倍型Os IDEF1的基因功能强弱,并进行其相关的转录激活强弱实验以及金属离子结合能力强弱实验对三种不同基因长度的Os IDEF1功能深度挖掘,获得如下结果:1.Os IDEF1基因转基因材料的获得及表型分析构建Os IDEF1基因的CRISPR/cas9载体和过表达载体,获得了两个稳定的基因敲除和过表达株系。对基因敲除和过表达株系进行缺铁胁迫处理,发现基因敲除突变体长势明显比野生型弱很多,并出现叶片发黄,而过表达突变体表型与其相反。2.Os IDEF1三种单倍型代换系构建及表型分析采用杂交的方法构建两种不同背景代换系:越光（KS）背景和吉粳88（J88）背景,获得稳定株系后通过PCR的方法鉴定单株基因型。在同一背景下选取不同单倍型的单株进行缺铁胁迫处理,观察表型后发现两种不同背景的群体表型均表明基因长度越短的Os IDEF1,基因功能越强。3.不同单倍型转录因子Os IDEF1的转录激活能力研究为验证不同单倍型Os IDEF1转录激活能力,选取其能够作用于下游Os IRO2启动子上的顺式作用元件IDE1作为转录激活位点,连接LUC相关载体后利用不同单倍型Os IDEF1转录激活,在烟草和原生质体两种体系中验证发现基因长度越短,转录激活能力越强。4.不同单倍型Os IDEF1与二价金属离子结合能力分析通过原核表达后纯化蛋白得到三种不同单倍型Os IDEF1,定量后通过螯合Fe2+的树脂,将结合在树脂上的Os IDEF1蛋白洗脱下来后通过Western Blot验证蛋白浓度,发现Os IDEF1基因长度越短,与二价铁离子的结合能力越强。综上所述,我们鉴定出水稻品种中存在三种单倍型的Os IDEF1基因;每种基因型相差12 bp,相差4个氨基酸;体内和体外活性初步证实:越短单倍型,其对铁的吸收功能越强;这将为今后分子辅助育种提供了理论基础。
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