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目的:构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85A、Ag85B编码基因的DNA疫苗,研究这两种DNA疫苗的免疫原性和保护效力。 方法:用PCR的方法扩增结核分支杆菌Ag85A、Ag85B编码基因,然后与真核表达载体pVAX1重组,构建的DNA疫苗经PCR、酶切和测序鉴定后,应用Qiagen试剂盒大量纯化无内毒素的质粒DNA。将C57BL/6小鼠随机分为5组,每组10只,分别用生理盐水(A)、载体质粒(B)、Ag85A DNA疫苗(D)、Ag85B DNA疫苗(E)通过肌肉注射的方法免疫小鼠,每3周免疫1次,共免疫3次;卡介苗(C)组每只小鼠腹部皮内注射,只免疫一次。通过ELISA方法检测血清中抗Ag85A、Ag85B抗体及其亚型。上述5组小鼠各取6只,第三次免疫后28天用结核分支杆菌H37Rv攻击,观察小鼠体重变化,攻击4周后检测细胞因子IFN-γ、IL-12,进行肺组织病理检查及菌落计数等。 结果:重组质粒Ag85A-pVAX1和Ag85B-pVAX1 DNA经PCR扩增分别可见1041bp Ag85A和978bp Ag85B特异性片段;经限制性内切酶Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ消化后也可见1041bp或978bp特异性片段;测序结果也表明成功地构建了Ag85A和Ag85B DNA疫苗。经Ag85A和Ag85B DNA疫苗免疫的小鼠特异性抗体IgG均显著高于对照组,而且IgG2b均高于IgG1和IgG2a。结核分支杆菌攻击后各组小鼠体重变化呈现不同趋势,A、B组小鼠体重从第3周开始下降;C组体重除第3周较前一周略有下降外,总体呈上升趋势;D组在第4周开始下降;E组体重第2周开始下降,之后维持不变。MTT法检测脾淋巴细胞增殖实验中D、E组的刺激指数显著高于其它组;D、E组小鼠脾淋巴细胞转化率也显著高于A、B组。肺组织菌落计数C组最低,其次是E、D组。大体病理结果显示C组和D组肺组织病变较A、B、E组轻。A和E组中各有2只,B组中有3只肺部有病变,充血较明显,组织有捻发感。小鼠肺组织切片镜下观察显示:A组小鼠约70~80%的肺泡腔内有大量渗出液,肺泡壁充血、水肿,小血管周围有少量淋巴细胞浸润,未见典型肉芽肿形成。B组肺泡壁肿胀、增厚、有少量淋巴细胞聚集,少数肺泡腔内充满渗出液,部分肺泡腔消失,未见典型肉芽肿形成。C组肺泡壁增厚,可见大量淋巴细胞聚集,并有肉芽肿形成,导致部分肺泡腔消失,肺泡腔内无明显渗出液。D组肺泡壁增厚,可见淋巴细胞聚集和肉芽肿形成,与C组类似,但肉芽肿数目比C组少,表现为增殖为主的病变。E组肺泡壁充血、增厚,部分肺泡腔萎陷,肺泡腔内渗出液不明显,可见少量淋巴细胞浸润,未见典型肉芽肿形成。各组小鼠未见干酪样坏死。 结论:Ag85A、Ag85B DNA疫苗都具有较强的免疫原性,呈THI型细胞介导的免疫应答; Ag85A DNA疫苗的免疫保护效力比Ag85B DNA疫苗强,但均不如BCG,有待进一步研究其应用价值。