研究背景宫颈癌(Cervical Cancer, CC)是女性常见恶性肿瘤,发病率排在第二位,是恶性程度最高的肿瘤之一。高危型HPV(HR-HPV)如HPV16,HPV18,HPV31等是宫颈癌致病的主要原因。相关报道显示,HR-HPV可在99.7%的宫颈鳞癌和94%-100%的宫颈腺癌中检出。E6与E7为HR-HPV主要的致癌蛋白。HPV在宿主细胞中主要以游离基因存在,受自身或宿主的蛋白调控。在极少数情况下,病毒基因组整合入宿主细胞基因组,使早期蛋白E6、E7表达增高,分别使p53、pRB这两个抑癌基因失活,改变细胞原有的生物学特性,抑制凋亡,使细胞周期、有丝分裂异常,最终导致细胞癌变。其中,E6可通过泛素化降解p53以消除其生长抑制信号,还可作用于其他凋亡相关蛋白,如Bak、c-Myc、 FADD和caspase8等多种途径来介导细胞癌变。E7通过保守的LXCXE模序与pRb结合,抑制pRb的作用,导致Rb-E2F复合物分解,释放出E2F,进而促进p16、c-Myc、细胞周期蛋白A和E(CyclinA/E)、p107、p130、CCNA2、MCM7、 CCNB1、CCNB2、MSH6等表达。E7还可通过调节许多其他蛋白表达,进而造成细胞癌变。微小RNA(microRNA,miRNA)是在真核生物中发现的、内源性的、具有调控功能的非编码RNA,其大小约20～25个碱基。miRNA能通过与靶mRNA的特异性碱基配对引起靶mRNA的降解、抑制或活化,对基因进行转录或转录后调控。若miRNA与靶mRNA完全互不配对,则会导致靶mRNA的降解。若配对不完全,miRNA抑制靶mRNA翻译。miRNA在生物体生长、发育,细胞分化、增殖和凋亡等过程中都起着重要作用。近来的研究表明,miRNA参与肿瘤、感染等多种疾病的调控。miRNA在肿瘤的形成过程,对细胞的癌基因和抑癌基因具有调控作用,可作为癌基因,或抑癌基因。由于组织环境和目标基因的不同,一些miRNA在一类肿瘤中是致癌的,而在另一类肿瘤组织中是起到抑癌作用的。因此,miRNA与肿瘤的发生、发展、转移、侵袭和预后等有关,现今被认为可作为肿瘤新的标志物。目前尚未发现由HPV编码的病毒miRNA,但HPV可以通过早期表达的调节蛋白作用于宿主细胞的miRNA,引起宿主细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为改变。例如,E6可通过降解p53,抑制miR-23b、miR-218、miR-34等miRNA的表达；E7能通过活化E2F诱导miR-15、miR-17-92、let-7a-d、let-7i以及miR.-106等miRNA的表达,从而促进肿瘤的发生发展。但是,HR-HPV病毒E6、E7调控miRNA在宫颈癌发病中的作用机制目前还未阐述清楚,尚待进一步研究。miR-27b是一个具有广泛功能的miRNA.其与糖尿病,脂质代谢,心血管疾病,病毒感染有关,同时也与肿瘤发生发展有关。在结肠癌、非小细胞肺癌、口腔癌、淋巴瘤、食管癌等肿瘤中,miR-27b具有抑癌作用,而在乳腺癌、神经胶质瘤等肿瘤中,miR-27b具有促癌作用,此外,miR-27b还与多种肿瘤耐药有关。miR-27b在宫颈癌中的研究较少,有研究通过miRNA芯片发现在HPV16阳性宫颈癌细胞株与HPV阴性宫颈癌细胞株C33A相比,HPV16阳性宫颈癌细胞株中miR-27b的表达明显上调。但其具体原因与机制未见进一步研究的报道。PPARy (Peroxisome Proliferator Activated Receptor y, PPARy)是miR-27b的靶基因之一,是过氧化物酶体增殖物激活受体。在脂肪细胞、巨噬细胞、神经母细胞瘤细胞等多种细胞中发现,miR-27b可通过与PPARγmRNA的3’UTR区结合,导致PPARγmRNA降解,从而抑制PPARγmRNA的表达。PPARγ为核受体转录因子,因此具有多种生物学功能。PPARγ可调节脂质代谢,降低血糖,具有抗炎作用。除此之外,PPARγ与肿瘤的发生发展也存在密不可分的关系,PPARγ具有促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤血管生成,抑制肿瘤干细胞的生长,抑制端粒酶的活性,从而抑制肿瘤生长等抑癌作用。有报道表明,PPARγ在宫颈癌组织中的表达高于癌旁组织。NHE1(Na+/H+Exchanger Isoforml, NHE1)是受PPARγ调控的下游基因之一,是一种细胞膜钠离子-氢离子转运蛋白,与肿瘤密切相关。NHE1是调节肿瘤pH值的主要蛋白之一。肿瘤的内碱外酸的微环境对正常细胞的恶性转化、肿瘤的发生发展起到十分重要的作用。NHE1就使细胞碱化,进而使细胞发生早期的恶性转化并在肿瘤进展过程中,对细胞增殖、转移及侵袭起到重要的作用。本研究在HPV16阳性宫颈癌细胞株中,利用小RNA干扰技术,沉默E6E7表达,通过miRNA芯片筛查,发现miR-27b表达显著下调。并再转染质粒分别使E6、E7过表达,发现miR-27b是由E7调控。在此基础上,通过细胞实验,对受miR-27b调控的下游基因PPARγ进行研究,进而再验证HPV16E7、miR-27b与PPARγ下游基因NHE1的关系,同时进行受miR-27b影响的细胞功能学研究。再通过HPV16阳性组织标本验证miR-27b在组织中的表达情况。本课题旨在寻找宫颈癌新的诊断指标或者治疗靶点。第一部分芯片筛选受HPV16E6/E7调控的miRNA研究目的利用miRNA芯片技术筛选出受HPV16E6、E7调控的miRNA。研究方法1.利用siRNA干扰技术靶向沉默宫颈癌细胞株CaSki细胞的HPV16、E7, Trizol收细胞,取部分提取RNA,逆转录成cDNA,利用荧光定量PCR技术以及Western Blot在mRNA和蛋白水平对干扰效果进行检测。2.检测干扰成功后,将剩下的样品利用芯片技术获得受HPV16E6或E7调控的miRNA。3.利用荧光定量PCR技术对芯片结果进行验证。4.过表达HPV16E6、E7,利用荧光定量PCR技术验证芯片结果。5.利用荧光定量PCR技术检测HPV16阳性宫颈癌细胞株CaSki、SiHa与HPV阴性宫颈癌细胞株C33A中所选miRNA表达水平。实验结果1.芯片结果与荧光定量PCR结果都显示靶向沉默HPV16E6、E7后, miR-27b的表达下调。2.荧光定量PCR结果显示过表达HPV E6或E7后,miR-27b在过表达E7后表达上调,而在过表达E6后无明显变化。3.通过荧光定量PCR结果发现在CaSki与SiHa细胞中,miR-27b的表达水平明显高于C33A细胞。结论1. HPV16E7在宫颈癌细胞中可使miR-27b表达上调。2. miR-27b在HPV16阳性宫颈癌细胞株中的表达高于HPV阴性宫颈癌细胞。第二部分HPV16E7调控miR-27b影响宫颈癌细胞增殖与侵袭功能的实验研究研究目的明确miR-27b作用的靶基因以及HPV16E7调控miR-27b的下游通路,并确定miR-27b以及其下游通路相关基因对宫颈癌增殖、侵袭等细胞功能的影响,以探索HPV16E7调控miR-27b在宫颈癌进展中的作用机制。并在HPV16阳性宫颈癌组织标本中验证HPV16E7、miR-27b以及下游通路相关基因的表达情况。研究方法1.将miR-27b mimics或inhibitors转染入宫颈癌细胞株中,利用荧光定量PCR技术检测miR-27b的表达情况,以验证miR-27b过表达与抑制的效果。2.将miR-27b mimics或inhibitors转染入宫颈癌细胞株中,利用荧光定量PCR技术以及Western Blot技术检测PPARγ以及NHE1的mRNA以及蛋白水平的表达情况。3.将miR-27b mimics或inhibitors转染入宫颈癌细胞株中,用CCK8实验检测miR-27b对细胞增殖的影响。4.将miR-27b mimics转染入宫颈癌细胞株中,用侵袭小室实验检测miR-27b对细胞侵袭的影响。5.将si-PPARγ转入细胞中,用荧光定量PCR技术以及Western Blot技术检测PPARγ以及NHE1的mRNA以及蛋白水平的表达情况。6.将si-PPARγ转入宫颈癌细胞株中,用CCK8实验检测PPARγ对细胞增殖的影响。7.将si-PPARγ转入宫颈癌细胞株中,用侵袭小室实验检测PPARγ对细胞侵袭的影响。8.将HPV16E7质粒转染入宫颈癌细胞株中利用荧光定量PCR技术以及Western Blot技术检测PPARγ以及NHE1的mRNA以及蛋白水平的表达情况。9.将HPV16E7质粒与miR-27b inhibitors共转染入宫颈癌细胞株中,利用Western Blot技术检测PPARγ以及NHE1蛋白水平的表达情况。10.利用荧光定量PCR技术检测6例HPV16阳性宫颈癌组织以及癌旁组织检测HPV16E7、miR-27b、PPARy以及NHE1mRNA的表达水平。实验结果1.荧光定量PCR与Western Blot结果显示过表达miR-27b可在mRNA与蛋白水平抑制其靶基因PPARγ的表达,可使NHE1的表达上调。而抑制miR-27表达可使PPARγ表达上调,NHE1表达下调。2.荧光定量PCR与Western Blot结果显示转染si-PPARγ后,NHE1的表达上调。3.荧光定量PCR与Western Blot结果显示过表达HPV16E7可下调PPARγ表达,上调NHE1的表达。若共转染HPV16E7与miR-27b inhibitors, HPV16E7对PPARγ与NHE1的作用减弱。4.CCK8实验结果显示过表达miR-27b可促进宫颈癌细胞增殖,而抑制miR-27b的表达可抑制宫颈癌细胞增殖。转染si-PPARy后可促进细胞的增殖。5.侵袭小室实验结果显示过表达miR-27b可促进宫颈癌细胞侵袭,转染si-PPARγ后可促进细胞的侵袭。6.荧光定量PCR结果显示,6例HPV16(+)宫颈鳞癌组织中HPV16E7s miR-27b以及NHE1的表达水平都高于癌旁组织；PPARγ则是癌组织的表达水平低于癌旁组织。结论1. miR-27b抑制其靶基因PPARy的表达,可使NHE1的表达上调。2. PPARγ抑制NHE1的表达。3. HPV16E7通过上调miR-27b的表达使PPARy表达下调、使NHE1的表达上调。4. miR-27b可促进宫颈癌细胞增殖与侵袭。5. PPARγ抑制宫颈癌增殖与侵袭。6.在HPV16(+)宫颈鳞癌组织Real-time PCR结果提示,HPV16E7、miR-27b以及N]HEl具有促癌作用,PPARγ具有抑癌作用。