肝内胆管癌Intrahepatic cholangiocarcinoma（ICC）是继肝细胞癌后第二高发的肝癌,且近年来发病率呈增高趋势。大多数ICC患者在初次诊断时,即已是晚期,错失了接受手术治疗---唯一可能治愈这一疾病的最佳时期。吉西他滨是一种核苷类似物,被广泛应用的化疗药物。吉西他滨为基础的化疗方案是治疗晚期ICC的标准治疗方案。然而,其治疗效果非常有限,缓解率相对较低。因此,开发新的靶向化疗药物来治疗这一恶性程度较高的肿瘤显得极为迫切。同时,小鼠模型在研究肿瘤形成和发展的分子机制,以及评估药物的治疗效果方面是不可或缺的。然而,ICC小鼠模型很少,且很难获得,影响了其应用,限制了相关临床前研究的开展。所以,有需要创建适宜的ICC小鼠模型,这可为治疗ICC的相关药物的临床前研究提供良好的实验手段,打下前期基础。v-akt murine thymoma viral oncogene homolog（AKT）/mammalian targetof rapamycin（mTOR）通路在多种肿瘤中出现异常激活。有证据表明,这条通路的激活在胆管癌中高发,分别在>60%的ICC中和>80%的肝外胆管癌中可检测到该通路的激活。AKT是通过被phosphoinositide 3-kinase（PI3K）磷酸化而激活的,磷酸化的AKT可激活其下游关键效应分子mTOR。mTOR作为催化亚单位,可与regulatory-associated protein of mTOR（RAPTOR）结合形成mTOR复合物1（mTORC1）,也可与rapamycin-insensitive companion of mTOR（RICTOR）结合形成mTOR复合物2（mTORC2）.mTORC1磷酸化p70 ribosomal protein S6 kinase（p70 S6K）和eukaryotic initiation factor 4E binding protein1（4EBP1）,进而分别激活the ribosomal protein S6（RPS6）和释放eukaryotic initiation factor 4E（e IF4E）。这些分子事件可促进mRNA的翻译和蛋白的合成,进而引起细胞的增殖和生长。mTORC2可通过激活包括AKT在内的多个激酶而实现其促进细胞增殖和存活的作用。因此,靶向AKT/mTOR通路可作为治疗ICC的一个重要的研究方向。但以往的研究都着重探讨第一代mTOR抑制剂---雷帕霉素及其类似物,并且大多是利用体外细胞系开展研究。MLN0128（也称为INK128）是一个选择性的、高效能的、口服有效的mTOR激酶抑制剂。MLN0128属于第二代mTOR抑制剂,是ATP类似物,通过结合至mTOR的激酶结构域来抑制mTORC1和mTORC2的催化活性。基于其具有优势的药理学效用,有关MLN0128的研究已被广泛开展。MLN0128作为单药或与其他药物联合已进入许多一期和二期临床试验,大多数是针对实体瘤的治疗。在针对包括白血病、肉瘤、乳腺癌、肾癌和结肠癌在内的多种肿瘤的临床前研究中,MLN0128表现出显著的治疗效果。与mTOR的变构抑制剂如雷帕霉素相比,MLN0128可以更加彻底的抑制mTORC1的活性,表现为更长期有效的抑制4EBP1的水平;MLN0128还能够靶向mTORC2起到抑制AKT通路的作用,因此可防止由于mTOC1得到抑制后AKT被反向激活;基于以上机制,MLN0128可带来更优的治疗效果。然而,目前还未见有关MLN0128在细胞系和动物模型中针对ICC疗效的研究报道。基于以上,本课题分为两个部分展开研究:第一部分AKT/Yap（Yes-associatedprotein）诱导的小鼠ICC模型的建立;第二部分MLN0128对AKT/Yap诱导的小鼠ICC的疗效及机制研究。第一部分AKT/Yap诱导的小鼠肝内胆管癌模型的建立本课题第一部分,我们首先在94例临床ICC标本中利用免疫组化方法,发现在绝大多数的临床ICC组织中AKT和Yap被激活,提示这两个癌基因的激活是促进ICC发生的重要分子事件。接着,我们利用水动力注射法稳定的在小鼠肝细胞中转染表达具有活性的AKT和Yap两种癌基因,创新性地建立了一种ICC小鼠模型（将在本研究中称为AKT/YapS127A）。该模型中,我们利用肉眼、H&E染色、免疫组化及天狼星红染色等方法观察,发现在注射质粒三周后,就可观察到ICC的形成,至注射质粒后5.5-6.5周左右小鼠发展致死负荷的ICC;并且AKT/YapS127A小鼠ICC组织具有管状表型,肿瘤间质中存在大量纤维结缔组织,表明其特征与人ICC组织病理特征相似。在成功建立这一ICC小鼠模型后,我们通过构建AKT-shRaptor质粒并与YapS127A一同注射入小鼠体内,发现敲低Raptor表达后,可有效抑制小鼠ICC的发展,并延长小鼠的存活。我们还在Rictor^flox/flox小鼠上应用水动力法注射AKT/YapS127A的同时,分别注射pT3-EF1α（空质粒）或pT3-EF1α-Cre（在本研究中分别简称为AKT/YapS127A/pT3和AKT/YapS127A/Cre）,发现敲除Rictor可抑制ICC的形成,明显延长小鼠的生存。Western blotting发现磷酸化的AKT（p-AKT S473和p-AKT T308）的表达在AKT/YapS127A/Cre小鼠的肿瘤组织中被有效地抑制了。以上结果表明mTORC1和mTORC2在AKT/YapS127A诱导的ICC的发生发展中都起着重要的作用。进一步利用人ICC细胞系HuCCT1和KMCH开展了体外研究,应用慢病毒转染shRNA沉默细胞中Raptor或Rictor基因表达之后,发现ICC细胞的克隆形成能力得到了显著的抑制,为mTORC1和mTORC2在ICC的发生发展中的重要作用提供体外证据。第二部分MLN0128对AKT/Yap诱导的小鼠肝内胆管癌的疗效及机制研究本课题第二部分,我们首先在AKT/YapS127A小鼠ICC模型中检测了吉西他滨的抗癌效果,因为以吉西他滨为基础的化疗方案仍被接受为治疗晚期ICC的标准方案。当肿瘤发展早期的时候,在注射质粒后3.5周,开始吉西他滨腹腔用药,每周一次,连续三周。结果发现对照组小鼠和处理组小鼠在肿瘤负荷和存活上都没有显著性差异。表明吉西他滨针对AKT/YapS127A小鼠ICC治疗无效。接下来,我们开展体外实验,观察到MLN0128可有效抑制人ICC细胞系的生长,western blotting实验结果显示,MLN0128可有效抑制细胞内AKT/mTOR信号通路,并引起凋亡相关分子的表达上升,却对增殖相关分子的影响不显著,提示MLN0128可诱导ICC细胞发生凋亡。MLN0128的小鼠体内用药是通过灌胃方式,每日一次,连续三周。实验结果发现,在ICC早期即注射AKT/YapS127A质粒后3.5周时开始给药,可显著抑制ICC的发展,在用药结束时,当溶剂对照组的小鼠都长出了致死负荷的ICC,而MLN0128处理组的小鼠都还处于健康状态,腹部大小正常,显著改善小鼠的生存。我们将MLN0128处理三周后的AKT/YapS127A小鼠肝脏与未接受MLN0128,即注射质粒后3.5周的AKT/YapS127A小鼠肝脏进行了比较,发现二者的ICC负荷是相似的,表明MLN0128几乎可以完全抑制AKT/YapS127A的ICC的生长。进一步机制研究发现,与体外实验结果一致,MLN0128能够有效的抑制AKT/mTOR信号通路,虽然对肿瘤细胞的增殖影响不显著,但可通过引起内质网应激（内质网应激的标志分子Bip和CHOP的表达升高）诱导AKT/YapS127A小鼠ICC肿瘤细胞发生凋亡。当在AKT/YapS127A小鼠晚期ICC即在质粒注射后5.5周时,开始MLN0128给药,发现其效果依然显著,在处理三天后,就可由于小鼠血性腹水迅速减少而引起小鼠的腹部明显缩小。整体肉眼观察和组织学证据都显示肿瘤的负荷在MLN0128处理一周、二周和三周后逐渐减少,肝脏重量也逐渐递减,MLN0128处理能够大大延长晚期AKT/YapS127A小鼠的存活。以上结果表明针对AKT/YapS127A小鼠ICC,与吉西他滨相比,MLN0128具有更好的疗效。综上所述,我们得出以下结论:1.AKT/Yap可诱导小鼠ICC的形成和发展;mTORC1和mTORC2在ICC的发生发展中起着重要的作用。2.MLN0128可抑制人ICC细胞的体外生长;针对早期和晚期的AKT/YapS127A小鼠ICC,MLN0128具有显著疗效,这一作用是通过MLN0128引起内质网应激进而导致肿瘤细胞凋亡来实现的。3.AKT/YapS127A小鼠ICC模型为ICC的相关临床前研究提供了一个很好的小鼠模型;该研究为mTOR抑制剂MLN0128可用于治疗ICC,尤其是AKT/mTOR通路发生激活的ICC,提供了实验基础与理论依据。