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成骨不全（osteogenesis imperfecta,OI），又称脆骨病，临床上通常以骨质疏松和骨的脆性增加，蓝巩膜，牙质形成不全为主要特征，约90%的患者是由I型胶原蛋白合成数量及结构的异常引起。I型胶原蛋白在人体各器官分布广泛，成骨不全患者常表现为皮肤松弛、肌肉薄弱、易骨折等症状，在组织病理特征上常表现为真皮胶原密度降低、肌纤维萎缩变细、骨小梁稀疏、变细等。目前国内外对基于大量样本的成骨不全病理学研究较少。本研究通过对成骨不全患者皮肤，骨骼肌及骨组织样本组织切片的定性以及定量分析，系统分析其病理学特征。研究方法：以0-6岁的50例髋关节脱位患者大腿部位的皮肤、骨骼肌、骨组织活检标本为对照，对相同部位及年龄段的74例成骨不全患者皮肤组织进行常规HE染色及Weigert-VanGieson双染法显示弹力纤维及胶原纤维；63例骨骼肌组织与107例骨组织进行HE染色及Masson三色染色区分肌纤维及胶原纤维。光镜下观察病理结构特征，同时采用Image-ProPlus6.0软件对表皮全层及细胞层厚度、真皮层厚度、真皮乳头层胶原束直径、真皮网状层胶原束直径、真皮层胶原纤维比例、真皮层弹力纤维比例、胶原纤维/弹力纤维相对量；肌纤维直径、肌纤维密度；骨小梁厚度、骨陷窝直径及密度、松质骨髓腔面积比例、皮质骨骨单位直径、皮质骨中央管直径进行标定与测量，通过SPSS17.0进行数据统计分析。另外，本研究对1例V型成骨不全患者及1例髋关节脱位患者股骨骨组织行透射电镜制片，观察其超微结构差异。结果：1.皮肤组织与对照相比，74例成骨不全患者皮肤组织中15例可见皮肤厚度较低，15例可见真皮网状层胶原纤维明显稀疏，3例可见皮肤中脂肪组织增多，8例可见弹力纤维增生、片段化，其余样本皮肤结构尚未见明显异常。定量统计表明，成骨不全患者真皮层厚度、真皮网状层胶原束直径、真皮层胶原纤维面积比例明显低于髋关节脱位组，分别为对照组的82.62%，80.40%及87.74%，两者差异有统计学意义；表皮全层厚度、表皮细胞层厚度及真皮乳头层胶原束直径分别为对照组的92.33%，94.57%，97.85%，但无统计学差异。另外，髋关节脱位对照组弹力纤维面积比例在3-8%之间，成骨不全组中8例真皮层弹力纤维面积百分比略见增大，其所占比例在8-11%之间，但二者间无明显统计学差异。2.骨骼肌组织63例成骨不全患者中，34.92%（22/63例）出现或部分出现不同程度的肌纤维萎缩、肌间脂肪增生、肌浆溶解，肌纤维粗细不均、变细等病理改变。其中0-1.5岁，3.1-4.5岁组肌纤维密度及4.6-6.0岁组肌纤维直分别为髋关节脱位组的87.65%，85.71%，82.17%，差异有统计学意义，其余各组虽均略有减小但差异无统计学差异。3.骨组织光镜下，79.44%（85/107例）的成骨不全患者骨组织会出现或部分出现以下不同程度的病理特征异常改变：皮质骨板层状结构不规则，骨胶原排列紊乱、含量降低，骨基质矿化异常，孔隙显著增大，髓腔增大增多；编织骨增多，骨小梁排列紊乱且稀疏、变薄，没有形成完整骨单位的趋势；骨陷窝增大增多，骨陷窝相连，部分可见成骨细胞增多。相对于髋关节脱位对照组，定量参数分析表明成骨不全组骨小梁厚度较对照组下降29.66%，骨陷窝直径增大43.57%，松质骨髓腔面积比例增大23.46%，差异有统计学意义。另外，皮质骨骨单位直径、中央管直径分别减少12.29%及13.30%，骨陷窝密度较对照组增大4.64%，但以上三个参数差异无统计学意义。对V型成骨不全患者的透射电镜观察显示该类型患者骨基质胶原纤维排列不规则，骨小管较多，骨细胞周围有少量蛋白聚糖聚集。结论：1.成骨不全患者骨组织样本病理异常变化明显，皮肤和骨骼肌组织均有不同程度的病理特征改变。2.本研究首次采用大规模样本进行皮肤、骨骼肌以及骨组织相关参数的定量分析，其量化的差异性病变指标：真皮层厚度、真皮网状层胶原束直径、真皮层胶原纤维面积比例，肌纤维密度，肌纤维直径，骨小梁厚度，骨陷窝直径，松质骨髓腔面积比例等体现了该类疾病的病理特征，可为该类疾病的临床诊断提供一定参考。3.组织病理病变指标与成骨不全的分型、严重程度的相关性等尚有待于进一步研究。成骨不全（osteogenesis imperfecta,OI）是一类具有遗传及表型异质性的结缔组织疾病，近几年陆续有新的常染色体隐性遗传致病基因突变可导致罕见的成骨不全。目前成骨不全分型达15种，共涉及15个致病基因，其中约90%的成骨不全患者是由常染色体显性遗传致病基因COL1A1、COL1A2及IFITM5基因突变所致，不到10%的患者由其余12个常染色体隐性遗传致病基因突变所致。常染色体隐性遗传的成骨不全往往表型更为严重，其致病分子机制常与I型胶原折叠、装配、分泌等过程相关。本课题对课题组前期检测COL1A1，COL1A2及IFITM5基因未发生突变的31例成骨不全样本进行SERPINF1、LEPRE1、PPIB、SERPINH1、FKBP10、OSX、BMP1、TMEM38B、WNT1、PLOD2、CREB3L1、CRTAP等12个常染色体隐性遗传致病基因的突变检测，旨在筛选出已知的成骨不全常染色体隐性遗传致病基因突变，分析其临床表型并预测其突变对蛋白质结构功能的影响。研究方法：提取成骨不全患者及其家庭成员外周血基因组DNA，待检测基因的PCR扩增产物经传统Sanger测序分析，利用Mutation Surveyor V4.0.6软件进行测序后突变位点的识别。候选位点经I型胶原蛋白突变数据库以及人类SNP数据库筛选确定。同时分析患者临床表型特征，并利用PolyPhen, Align GVGD，SIFT和Mutation Taster软件预测氨基酸变异对蛋白质功能的影响，应用Swiss PDB Viewer V4.1分析突变对蛋白质三维结构的影响。结果：31例成骨不全患者样本的检测表明，6例为WNT1突变，2例为SERPINF1突变,23例在所有检测的常染色体隐性遗传的12个致病基因中尚未发现突变。6例WNT1突变中，4例为复合杂合突变:c.301C>T+c.681C>A（p.Arg101Cys+p.Cys227X）、681C>A+c.1010G>C（p.Cys227X+p.Arg337Pro）；c.397G>A+c.677C>T（p.Ala133Thr+p.Ser226Leu）；2例为WNT1纯合突变c.677C>T（p.Ser226Leu），c.466delC（p.Arg156Glyfs*43）。2例SERPINF1突变分别为c.907C>T（p.Arg303X）纯合终止突变与c.245246hetdelAG+c.397C>T（Leu83Glnfs*28+p.Gln133X）复合杂合突变。患者表型主要累及长骨及脊柱，软件预测分析后可见各突变位点均可影响编码蛋白功能，并可使编码蛋白3D结构发生功能性改变。结论：WNT1与SERPINF1基因突变在中国成骨不全患者中较为常见，本研究尚未发现其它常染色体隐性遗传致病基因突变，未发现致病突变的23例成骨不全样本为深入寻找新的成骨不全候选致病基因奠定了基础。