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据统计,全世界每天约有1500万患者经受癌痛的折磨。其中60%-90%的晚期肿瘤可发生骨转移,乳腺癌、肺癌、前列腺癌和血液系统的多发性骨髓瘤等常常优先转移至骨,可进展为顽固性的骨癌痛。目前,骨癌痛已成为影响晚期癌症患者生活质量最严重的问题之一。骨癌痛的特点是骨转移相关部位持续的慢性痛和间断加剧的爆发性痛。目前,临床上对于骨癌痛尚缺乏有效的治疗手段。其原因是骨癌痛的发生及发展机制并未阐明。那么是否可以从癌痛相关基因的筛查中找到线索呢?本课题首先应用RNAseq（RNA Sequencing）技术对骨癌痛大鼠背根神经节（Dorsal Root Ganglion,DRG）的转录组进行分析,筛选出参与骨癌痛发生的关键基因;在此基础上,应用荧光实时定量PCR、免疫组化、Elisa和western-blot等方法确认该关键基因在骨癌痛大鼠背根神经节上的差异性表达;进一步应用鞘内给药的方法研究该关键基因对骨癌痛模型大鼠痛觉行为的影响。通过以上研究,有助于进一步阐明骨癌痛的发生发展机制,并为寻找治疗骨癌痛的新靶点提供理论依据。第一部分:基于RNAseq（RNA Sequencing）技术的骨癌痛大鼠背根神经节转录组学的研究目的:本实验拟应用RNAseq技术全面分析假手术组和骨癌痛组大鼠背根神经节（DRG）组织的转录组,筛选出差异表达基因,进而对差异表达基因进行GO（Gene Ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析,寻找参与骨癌痛痛觉敏化的关键靶点,为骨癌痛的分子机制研究提供实验依据和理论基础。方法:选择清洁级成年雌性SD大鼠20只,随机分为Sham组和骨癌痛（Bone cancer pain,BCP）组进行实验,骨癌痛组大鼠右侧胫骨骨髓腔内注入Walker256乳腺癌细胞2×104/μl（10μl）建立大鼠胫骨癌痛模型,Sham组大鼠右胫骨骨髓腔内注入等体积的生理盐水作为对照。分别于术前1d（基础水平）、术后4、7、11、14、17、19、21d测定机械缩足反应阈值（Paw mechanical withdrawal threshold,PMWT）和行走痛评分（limb use score during normal ambulation）。借助这种痛觉检测方法和术侧胫骨X线影像学检测共同确定造模是否成功。随机选取3对假手术组和骨癌痛组大鼠,取同侧L3-L5背根神经节（DRG）进行RNAseq检测。采用RNAseq技术,分别检测两组DRG组织的全转录组表达水平,利用泊松分布数理统计模型筛选两组大鼠中具有统计学意义的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）;然后应用生物信息学方法（GO分析和KEGG通路富集分析）,进一步筛选出在骨癌痛痛觉敏化中发挥关键作用的基因。结果:采用RNAseq技术对Sham组和BCP组大鼠的DRG组织进行了全转录组测序分析。结果发现,与Sham组相比,BCP组大鼠DRG神经元中有725个基因表达发生了变化,其中536个基因表达上调,189个基因表达下调（P<0.01）。使用GO对差异表达基因的细胞定位、分子功能和生物学进程进行注释,发现与Sham组相比,BCP组DRG神经元中的差异表达基因主要定位在细胞膜、突触和高尔基体。这些差异表达基因与蛋白结合和酶的催化活性或调节活性密切相关,参与了炎症反应、神经递质合成和转运、突触可塑性,信号转导等诸多生物学进程。进一步使用KEGG对差异表达基因参与和富集的信号通路进行分析,结果表明Sham组大鼠相比,BCP组差异表达基因主要富集的通路包括Hippo、mTOR、TGF-β,类固醇生物合成、维生素消化吸收、组氨酸代谢等多条信号通路,其中Hippo、mTOR、TGF-β等多条信号通路被激活,而类固醇生物合成、维生素消化吸收、组氨酸代谢等信号通路则被抑制。综合RNAseq、GO和KEGG分析显示,TGF-β家族的骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein）BMP2、BMP4、BMP15及其BMP2受体Bmpr1b的基因表达在BCP组与Sham组表达差异明显(P值分别为BMP2:4.65×10-4;BMP4:7.9×10-4;BMP15:9.87×10-5;Bmpr1b:1.54×10-4),并在GO树和KEGG树中都处于关键位置。结论:骨癌痛大鼠背根神经节中多种基因表达水平出现显著性改变,如表达BMP及其受体基因等。第二部分:BMP2参与骨癌痛大鼠外周痛觉敏化的形成目的:探讨BMP2在骨癌痛大鼠外周痛觉敏化机制中的作用。方法:利用免疫组化、荧光实时定量PCR、Elisa、western-blot方法检测Sham组和BCP组大鼠同侧L3-L5DRG组织中BMP2表达。术后7天,将Sham组和BCP组大鼠分别随机分为2组,分别鞘内注射能干扰DRG组织BMP2表达的RNA片段（BMP2-siRNA）和阴性对照RNA片段（NC-siRNA）,即骨癌痛+BMP2-siRNA组,骨癌痛+NC-siRNA组,假手术+BMP2-siRNA组,假手术+NC-siRNA组。于术后0,1,4,7,11,13,15,17,19天进行大鼠疼痛行为学检测,观察干扰DRG组织中BMP2的表达后,骨癌痛大鼠的疼痛行为学是否发生变化。结果:与Sham组相比,BCP组大鼠DRG组织中BMP2的mRNA和蛋白表达显著升高;与骨癌痛+NC-siRNA组相比,鞘内注射BMP2-siRNA干扰DRG组织BMP2的表达后（4,6,8,10,12天）大鼠机械痛缩足阈值明显升高;与骨癌痛+NC-siRNA组相比,鞘内注射BMP2-siRNA（6,8,10天）组大鼠行走评分明显升高,鞘内干扰后4、12天行走评分无明显改善,假手术各组疼痛行为学无显著差异。结论:骨癌痛大鼠DRG组织中BMP2的表达上调;干扰DRG组织中BMP2的表达,可缓解骨癌痛模型大鼠的痛觉敏化现象。