论文部分内容阅读
内皮依赖性超极化因子（endothelium-derived hyperpolarizing factor, EDHF）是血管内皮细胞通过非环氧化酶、非一氧化氮合酶途径产生的一种血管舒张因子。EDHF反应在多种属、多部位血管上均有存在,但脑血管中的EDHF化学本质尚不清楚,本室前期实验表明大鼠脑基底动脉存在有EDHF反应,并可能与内源性硫化氢（H2S）有关。金丝桃苷（ hyperin, Hyp,金丝桃甙）,化学名槲皮素-3-O-β-D吡喃半乳糖苷,是一种广泛存在于多种植物中的黄酮醇苷类化合物。本实验室曾对Hyp药理作用进行了大量的研究,结果表明Hyp有明显的抗脑缺血损伤作用。本文研究了Hyp对大鼠脑基底动脉舒张作用,探讨了Hyp抗脑缺血再灌注损伤作用机制,尤其是其作用与EDHF及有关离子通道的关系。实验目的:1. Hyp对大鼠脑基底动脉的舒张作用及其机制;2. Hyp抗大鼠脑缺血再灌注损伤作用的EDHF机制;3.研究Hyp诱导的EDHF反应与有关离子通道的关系。实验方法:1.采用离体血管舒缩功能测定法,观察Hyp对大鼠脑基底动脉的舒张作用,合用NO合酶抑制剂L-NAME和PGI2合成酶抑制剂Indomethacin对Hyp舒张作用的影响;KCa阻断剂TEA或内源性H2S合成酶抑制剂PPG（DL-炔丙基甘氨酸）对Hyp引起的非NO、非PGI2舒张作用的影响;NaHS及L-Cys对血管舒张作用。2.采用细胞内电位记录实验方法,研究Hyp对大鼠脑基底动脉平滑肌细胞的超极化作用,合用L-NAME和Indomethacin对Hyp超极化作用的影响;TEA或PPG对Hyp引起的非NO、非PGI2超极化作用的影响;NaHS和L-Cys的超极化作用。3.急性消化分离脑基底动脉平滑肌细胞,全细胞膜片钳法记录Hyp、NaHS及L-Cys对平滑肌细胞钙激活的钾电流的影响。4.四血管结扎法建立大鼠全脑缺血模型,观察PPG对Hyp抗脑缺血损伤作用的影响;采用免疫磁珠法分离大鼠脑动脉内皮细胞,利用RT-PCR的方法检测内源性H2S合成酶—CSE的表达,观察分析Hyp抗脑缺血损伤作用与CSEmRNA表达的关系。5.采用全自动酶标仪测定各组缺血再灌注大鼠脑组织硫化氢的含量。实验结果:1在离体血管舒缩功能测定中,在30 mmol/L KCl预收缩的大鼠脑基底动脉上,Hyp可产生浓度依赖性的舒张作用,其最大舒张率是69.8±7.1%,EC50为20.4±4.5μM;去除血管内皮后,Hyp舒张作用显著减弱。2在细胞内记录膜电位实验中,Hyp可引起大鼠脑基底动脉平滑肌细胞产生浓度依赖性的超极化作用,最大超极化效应Emax为-12.5±3.2 mV,与溶媒对照组比较差异有显著性（P<0.01）;而去除血管内皮后,Hyp超极化作用明显减弱,其最大超极化效应Emax降为-3.17±0.47 mV,与内皮完整组相比,差异有显著性。3应用NO合酶抑制剂(L-NAME , 3×10-5 mol/L)和PGI2合成酶抑制剂(Indomethacin,Indo,10-5 mol/L)后,Hyp对大鼠脑基底动脉舒张作用明显减弱,但还存在明显舒张作用,其最大舒张率为51.6±6.2%,与溶媒对照组比较差异有显著性（P<0.01 vs vehicle）;在细胞膜电位记录实验中,应用L-NAME和Indo后,Hyp对大鼠脑基底动脉平滑肌细胞的超极化作用并未被完全抑制,仍保留明显的超极化作用,其最大超极化幅度为-8.7±3.4 mV（P<0.01 vs vehicle）。4合用L-NAME和Indo以及钙激活的钾通道（ KCa ）阻断剂四乙胺（tetraethylammonium,TEA,1 mmol/L）预处理时,Hyp引起的舒张和超极化效应均被显著抑制,最大舒张率和最大超极化幅度分别为28.6±4.4%与-4.8±2.5 mV,与Hyp+L-NAME+Indo组相比差异有显著性,提示Hyp内皮依赖性的非NO、非PGI2超极化和血管舒张作用可能与KCa有关。5应用内源性H2S合成酶——胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase, CSE）的阻断剂DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PPG,10-4 mol/L)可显著抑制Hyp对大鼠脑基底动脉引起的内皮依赖性的非NO、非PGI2的血管舒张作用;同样,在细胞膜电位记录实验中也发现,PPG对Hyp的内皮依赖性的非NO、非PGI2超极化也有类似的抑制作用（P<0.05或P<0.01）。6应用10-5 10-3 mol/L NaHS（H2S外源性供体）,能显著地引起大鼠脑基底动脉舒张及超极化,最大舒张率和最大超极化幅度分别为-61.6±7.7%与-11.7±3.8mV,与溶媒对照组相比差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。7在离体血管舒缩功能测定实验中发现,合成H2S的底物L-半胱氨酸(L-Cysteine, L-Cys, 10-6 10-4mol/L)可产生浓度依赖性的舒张作用。8全细胞膜片钳记录平滑肌细胞钙激活的钾电流实验中发现,10-6 10-4 mol/L Hyp对胶原酶消化的大鼠脑基底动脉平滑肌细胞外向电流无显著影响;内源性H2S生成的底物L-Cys(10-4 mol/L)与外源性H2S的供体NaHS(10-5 10-4 mmol/L)能使外向电流显著增强（P<0.05 or P<0.01）,此增强效应能被TEA（1 mmol/L）所阻断。9大鼠全脑缺血时,其脑电图幅度迅速下降,再灌注后脑电图幅度有所恢复。2.5 10 mg/kg Hyp对缺血再灌注,尤其是对再灌注45 60 min时的脑电图幅度恢复有显著的改善作用（P<0.05 or P<0.01）;同时能不同程度地改善脑缺血再灌注大鼠脑组织病理组织学的改变,减少血清LDH活力和脑组织MDA含量,并减轻脑水肿（P<0.05或P<0.01）。37.5 mg/kg PPG可明显抑制10 mg/kg Hyp对上述各项指标的改善作用（P<0.01）;2.5 10 mg/kg Hyp可明显抑制大鼠全脑缺血再灌注损伤引起的脑组织H2S含量的降低（P<0.01）。10利用RT-PCR技术半定量检测了大鼠全脑缺血再灌注各组脑血管内皮细胞中CSE mRNA表达水平,结果显示,Hyp（5、10 mg/kg）可以显著上调CSE的mRNA表达水平（P<0.01）,但PPG可明显抑制Hyp上调CSEmRNA水平（P<0.01）。结论:1. Hyp对大鼠脑基底动脉具有内皮依赖性和内皮非依赖性的血管平滑肌细胞膜电位超极化和血管舒张作用;2. Hyp的内皮依赖性平滑肌细胞超极化和血管舒张作用有NO或和PGI2机制参与,更涉及有EDHF反应,其EDHF反应与H2S生成有关;3. Hyp对急性分离的大鼠脑基底动脉平滑肌细胞的钙激活的钾电流未见显著性影响;但外源性和内源性H2S（假定的EDHF,EDHF/H2S）可增强这种钙激活的钾电流,提示Hyp可通过提高血管内皮EDHF/H2S的产生,间接地舒张脑血管;4. Hyp对大鼠脑缺血-再灌注损伤保护作用与EDHF/H2S有关,可抑制缺血-再灌注大鼠脑血管内皮中CSE（EDHF/H2S合成酶）mRNA表达的降低;5. Hyp可抑制脑缺血-再灌注大鼠脑组织H2S含量的降低;6.本研究也为确定H2S为大鼠脑基底动脉中的EDHF提供了一个有力的佐证。