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第一部分体外诱导外周血记忆B淋巴细胞分化抗原特异性浆细胞方法的建立背景:新型感染性疾病因其传染性强易导致暴发流行,抗体作为免疫防治的策略之一,可以用于应急预防以及重症患者的治疗。全人源单克隆抗体(单抗)具有特异性高、毒副作用低、可大量生产等优点。新型感染性疾病爆发流行,快速筛选相应的中和抗体可以用于预防和治疗。中和抗体的制备通常采用患者恢复期外周血单个核淋巴细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),但是患者恢复期PBMCs中特异性浆细胞含量极低,难以捕获。体外诱导PBMCs中记忆B淋巴细胞(后简称B细胞)分化抗原特异性浆细胞的方法可获得大量浆细胞用以抗体基因的提取,为全人源单抗的制备提供研究基础。目的:本研究旨在建立体外诱导外周血记忆B细胞增殖并分化抗原特异性浆细胞的方法,以期自PBMCs中获得大量抗原特异性浆细胞用以分离抗体基因,为制备高亲和力的、具有中和作用的全人源单抗药物研究提供研究基础。方法:本研究收录接种乙肝疫苗超过3年以上的健康志愿者,使用密度梯度离心法分离PBMCs,分别使用TLR7/8激动剂R848或TLR9激动剂CpG DNA 2006与不同细胞因子(IL-2、IL-4、IL-10)组合的方式进行诱导活化,体外诱导6天后评价活化效果。使用台盼兰对活化后细胞染色并计数,绘制细胞生存曲线图检测细胞生存状态;使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清中总IgG或/和HBsAg抗原特异性IgG的分泌量;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测活化细胞中总抗体分泌细胞(Antibody secret cells,ASCs)或/和HBsAg抗原特异性ASCs数量,分析不同诱导方案的活化效果。诱导方案分别为:不同浓度R848和IL-2(后缩写为R848+IL-2)组合诱导,用以确定R848使用的最佳浓度;R848+IL-2联合不同细胞因子(IL-4、IL-10)组合诱导,用以确定细胞因子对R848诱导活化的影响;CpG DNA 2006和CD40抗体联合细胞因子IL-2、IL-4和/或IL-10组合诱导,用以确定使用CpG DNA 2006活化效果最优的组合。结果:1.R848+IL-2体外方案最佳浓度及细胞因子对活化效果的影响:ELISA及ELISPOT结果表明,R848与IL-2联合使用,当R848浓度在1-2.5μg/ml时,能够有效诱导B细胞扩增分化为浆细胞,且最早在活化后第5日即可检测到ASCs;细胞因子IL-4、IL-10对R848+IL-2联合诱导B细胞活化的方法并无明显影响;2.CpG DNA 2006体外诱导方案的最优组合:对CpG DNA 2006与不同细胞因子组合诱导的结果进行检测证明,在抗CD40抗体作用下,CpG DNA 2006与细胞因子IL-2、IL-4和IL-10联合使用能够更好诱导PBMCs中B淋巴细胞分化为ASCs;3.两种体外诱导方案的对比:对R848+IL-2(R848组)或CpG DNA2006+CD40抗体+IL-2、IL-4、IL-10(CpG组)两种方法的活化效果进行比较,发现R848组能够更有效分化ASCs,ELISPOT浆细胞检出率至少高出CpG组8倍以上;4.R848+IL-2诱导抗原特异性ASCs:使用R848+IL-2方法诱导接种乙肝疫苗(3年及以上)的健康志愿者PBMCs后,ELISA可在细胞上清中检测到HBsAg特异性IgG且ELISPOT能够检测到HBsAg特异性浆细胞(频率大约在1/100-1/1000)。结论:R848+IL-2或在抗CD40抗体作用下,CpG DNA 2006与细胞因子IL-2、IL-4和IL-10联合这两种方法,均可体外诱导PBMCs中记忆B细胞增殖分化为浆细胞。使用R848+IL-2方法,仅需少量患者恢复期外周血(5-10ml)便可获得抗原特异性ASCs用于分析和分选,为中和抗体的制备提供方法。第二部分全人源乙肝表面抗原抗体的制备及其特性鉴定背景:乙型病毒性肝炎是乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染所导致的、严重危及人类健康的传染性疾病。我国是HBV感染的高发区,因目前对慢乙肝患者尚缺乏有效治疗,故常导致疾病迁延不愈,增加了并发症的风险。应用于临床的高效价免疫球蛋白能够中和并清除入侵的病毒,使机体免受病毒的感染,但由于血源来源有限、制备成本高等问题,致使应用受到了限制,寻找一种有效治疗乙肝的药物显得尤为迫切。乙肝治疗性疫苗是指按照一定比例,在仅使用抗原制备疫苗的基础上额外添加HBs Ag抗体,对其的研究目前已经入临床III期,证实其有一定疗效。构建具有高亲和力的HBs Ag全人源单克隆抗体,使大规模生产人源化抗体成为可能,为乙肝的临床治疗和治疗性疫苗的发展提供研究基础。目的:构建并表达多对全人源HBs Ag单克隆抗体,制备抗体蛋白,检测其纯度及特异性;建立细菌展示技术,探讨HBs Ag抗原表位。本课题研究,以期为单克隆抗体的制备、抗原表位的筛选以及乙肝治疗性疫苗的研发提供基础。方法:1.重组质粒的构建:通过PCR的方法,获得HBs Ag抗体轻、重链可变区基因及人/鼠Ig G轻、重链恒定区基因,使用overlap PCR的方法分别将轻、重链的可变区与恒定区相连接,克隆至真核表达载体Pc DNA3.4中,构建重组质粒。通过酶切及基因测序,验证质粒的准确性;2.293F真核系统表达抗体蛋白:将鉴定正确的质粒转染293F细胞,收集包含目的蛋白的细胞培养液上清,利用Protein G亲和层析柱对其进行纯化,得到纯度及浓度均较高的抗体蛋白;3.抗体蛋白纯度检测:使用SDS-PAGE胶进行考马斯亮蓝染色,对纯化后抗体蛋白纯度进行检测;4.抗体蛋白活性及特异性结合力检测:使用ELISA检测抗体蛋白的活性及其对HBs Ag的特异性结合力;使用免疫组化方法检测HBV相关HCC患者石蜡切片样本中HBs Ag的表达水平;5.细菌展示技术的建立:将HBs Ag ADR/AYW亚型基因序列克隆至细菌展示载体,使用所制备的不同抗体与其反应,探究抗体与抗原的结合情况。结果:1.成功构建5对全人源HBs Ag单克隆抗体的轻、重链表达质粒,分别命名为HBs Ab-h116、HBs Ab-h1444、HBs Ab-h1425、HBs Ab-h1453、HBs Ab-h477,将其中2对HBs Ab-h116和HBs Ab-h477改造为嵌合鼠源。酶切后质粒经琼脂糖凝胶电泳后出现两条条带,其与理论大小相符;比对测序结果,显示插入序列正确;2.成功使用293F细胞将抗体进行表达,并使用Protein G亲和层析柱纯化,使用SDS-PAGE胶进行考马斯亮蓝染色后,7对抗体均显示轻、重链两条清晰条带,相对分子质量分别约27000和55000,无明显杂带,证实抗体纯度较高;3.使用ELISA包被HBs Ag对制备抗体进行检测,结果证实抗体均对HBs Ag具有特异性结合能力;使用HBV相关HCC患者样本制备石蜡切片,使用免疫组化对改造后的嵌合鼠源抗体HBs Ab-m116和HBs Ab-m477进行验证,结果显示所制备抗体可特异性结合样本中HBs Ag;4.成功建立细菌展示方法,构建含有乙肝表面抗原ADR、AYW亚型全长基因的细菌展示APEX载体,使用流式检测证实制备的HBs Ab-h116及HBs Ab-h1444能够与ADR亚型有较明显反应,较其他几对亲和力高,后续可将抗原进行进一步截短,筛选线性表位。结论:成功构建5对全人源及2对嵌合鼠源HBs Ag抗体轻、重链表达质粒,并在真核细胞293F中进行表达后纯化。纯化后抗体蛋白纯度较好且对HBs Ag有特异性结合能力。成功建立细菌展示技术,证实所制备HBs Ab-h116及HBs Ab-h11444能够与ADR亚型全长有较明显反应,为单克隆抗体的制备、抗原表位的筛选及乙肝治疗性疫苗的研发提供研究基础。