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高温可影响作物生长和籽粒发育,最终影响作物产量。随着全球平均气温的逐步升高,高温影响作物生长发育的研究越来越受到重视。小麦是我国北方重要粮食作物,其生育进程中常遇到极端温度、干旱等逆境,尤其生长发育后期的干热风天气,可造成小麦产量下降及品质变劣。缓解高温胁迫对全球小麦产量造成的损失是当前农业发展所面临的迫切问题。 本研究在室内水培和田间栽培条件下,对高温抗性不同的小麦品种喷施硫氢化钠(NaHS)溶液,运用形态学、生理生化及分子生物学等手段研究 NaHS对高温下不同基因型小麦的影响,旨在明确NaHS缓解小麦高温胁迫的生理机制。主要研究结果如下: 1.本试验在传统固体基质育苗方法的基础上,优化并建立了小麦幼苗的筛选及培育新体系(国家发明专利受理号:201510975062.9),该体系克服了传统育苗方法长势不均一的弊端,可在试验用幼苗的整个培养过程中保证其长势的均一稳定性。 2.本试验选用经过多年田间干热风抗性重复鉴定且已知其抗性水平的8个小麦材料,以各品种生长20 d的幼苗经38℃高温胁迫24 h再在20/15℃环境中恢复生长一周后的苗干重及苗干重抗逆系数为筛选指标,建立了苗期抗、感高温品种筛选的评价体系,并利用该体系优化筛选得苗期高温抗性有差异的品种鲁原502和济麦22,用于进一步的试验研究。 3.为了明确NaHS对小麦幼苗的高温缓解作用,选用济麦22幼苗为材料,以相同胁迫处理后的苗干重为评价指标,确定了在小麦幼苗生长的第16、18和第20天各喷施一次0.15 mM的NaHS溶液,能显著缓解小麦幼苗的高温胁迫。同时利用多种NaHS类似物的喷施,排除了Na+及其他价态硫元素的高温缓解效应,再结合H2S清除剂亚牛磺酸和H2S合成抑制剂丙酮酸钾的喷施,确定了NaHS溶液中起高温缓解作用的效应分子是H2S(国家发明专利受理号:201510973618.0)。 4.为了研究Ca2+-CaM信号在NaHS缓解高温中的作用,以济麦22幼苗为材料,研究高温下外源喷施NaHS、Ca2+、Ca2+螯合剂、Ca2+运输载体、钙通道抑制剂、钙调素拮抗剂等溶液对幼苗苗干重的影响。结果显示:Ca2+参与了NaHS的高温缓解作用,且该缓解作用是由于外源Ca2+的内流而非内源钙库的释放引起的。再结合CaM基因在各处理间的表达情况证明了Ca2+-CaM信号参与了NaHS的高温缓解作用。 5.为了解析H2S缓解小麦幼苗高温胁迫的机制,以济麦22幼苗常温未喷(NP-NT)、常温喷施(P-NT)、高温未喷(NP-HT)和高温喷施(P-HT)四个处理24 h的叶片进行了转录组测序分析,获得的与NaHS的高温缓解作用有关的差异表达基因中,除了功能未知的新基因外,其余基因主要参与光合作用调节、转录调控、抗氧化防御、物质转运、能量代谢和氨基酸代谢等途径。选取部分转录因子和代谢酶基因等利用qRT-PCR技术与转录组测序的结果进行了表达趋势的验证,结果显示,所选基因的表达趋势与测序结果基本一致,但基因表达的差异倍数不尽相同。随后以氧化还原活性为中心,研究了光合荧光系统、可溶性物质含量及抗氧化防御系统等生理生化指标对外施NaHS的响应。 6.为了研究光合及荧光系统对外施NaHS的响应,以济麦22幼苗为材料进行光合荧光参数的测定。恢复生长初期叶片的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线显示,喷施株表现出较低的初始荧光(Fo)及较高的综合性能指数(PIABS)和psbA基因的表达量,同时喷施株在恢复生长阶段的叶绿素含量及净光合速率均增长更快,说明外施NaHS可减轻高温胁迫对光合机构的损伤,有利于光合同化物的积累,暗示NaHS对小麦苗干重降低的缓解可能通过增强光合作用实现的。 7.为了研究小麦幼苗中可溶性物质含量对外施NaHS的响应,以鲁原502和济麦22的幼苗为材料,进行可溶性物质代谢的测定。结果显示,外施NaHS可通过提高L/D-半胱氨酸脱巯基酶活性(L/D-CDs)及基因表达提高高温胁迫初期叶片中的H2S含量。并通过增强Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)及鸟氨酸转氨酶(OAT)的基因表达量,降低脯氨酸脱氢酶(ProDH)的基因表达,提高叶片中游离脯氨酸的净含量,还可提高可溶性糖含量,并提高水孔蛋白(AQP)及蔗糖转运蛋白(SUT1)的基因表达,减小叶片相对含水量(LRWC)的降低幅度,而维持较高的渗透压及物质转运能力,从而缓解高温对小麦幼苗的损伤。 8.为了研究小麦幼苗中抗氧化系统对外施NaHS的响应,以鲁原502和济麦22的幼苗为材料,进行酶性抗氧化剂及非酶性抗氧化剂的测定。结果显示,NaHS对正常温度下的活性氧清除系统的影响不显著;在高温条件下,外施NaHS可通过增强半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)和谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)的基因表达提高了胁迫初期非酶性抗氧化剂抗坏血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)的含量,并通过提高单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)及谷胱甘肽还原酶(GR)的基因表达及酶活性提高了AsA和GSH的再生速率,减轻AsA和GSH的还原型/氧化型的比值的下降幅度;外施NaHS可通过增强超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及抗坏血酸过氧化物酶(APX)等酶性抗氧化剂的活性及同工酶基因的表达水平,提高了幼苗抗氧化能力以清除过量的H2O2和O2·-,减轻膜脂过氧化。表明外施NaHS可通过调控抗氧化防御系统增强活性氧清除能力缓解小麦幼苗的高温胁迫。 9.为了确定外施NaHS对灌浆期小麦高温胁迫的影响,以大田中生长的济麦22为材料,在花后10 d,利用搭建干热风大棚进行模拟干热风胁迫处理10 d。结果显示,干热风胁迫可极显著降低籽粒千粒重,而外施NaHS可显著缓解籽粒千粒重的降低,同时该缓解作用可能与干热风胁迫下籽粒中可溶性淀粉合成酶(SSS)活性的维持有密切关系。