荧光假单胞菌是乳制品中常见的污染菌,能够分泌耐热的胞外蛋白酶和脂肪酶。这些酶经过高温灭菌仍具有活性,能够分解乳制品中的蛋白和脂肪,使乳制品发生腐败、变质等质量缺陷。传统的标准平板培养检测方法时间长,重复率低,不能满足快速高通量检测乳品的要求,无法应用于大批量产品的实际检测中。鉴于此,我们希望能够建立起一种高效快速的检测方法。聚合酶链式反应(PCR)技术自问世以来,因其高效特异且实验过程简便快捷等优点而备受人们青睐[1]。而目前PCR检测食品中荧光假单胞菌的方法依然处于探索阶段,已有文献报道的检测靶点少,且缺乏系统评价。本实验在前人探索的基础上,利用已有报道的三株荧光假单胞菌的序列信息,选择高度保守的gyr B基因以及特异的apr基因为标记基因,设计了10对单重引物,并筛选了两对引物(gyr B384和apr194),在此基础了建立了荧光假单胞菌双重PCR方法。经过反复实验最终确立了引物浓度配比(gyr B 0.64μmol/L,apr 0.4μmol/L),在该比例下,引物之间的互相干扰最小,产物条带(384 bp和194 bp)能够通过电泳实验直接用肉眼区分开;经过退火温度优化实验,最终确立60℃的退火温度,使得PCR产物特异性最佳,且能达到最低检测灵敏度(16.9 fg/μL);人工污染实验表明本研究设计的两对引物能够克服样品基质的干扰,而实际样品检测实验表明双重PCR实验能够应用于实际检测中。本研究建立的双重PCR检测体系特异性高,灵敏度强,能够克服单重PCR“假阳性”的缺点,值得在实际检测中推广使用。假单胞菌胞外蛋白酶能将牛乳中的酪蛋白水解,使牛乳沉淀、变苦,从而影响奶酪的发酵产量。传统的脱脂乳平板法只能定性检测假单菌胞外蛋白酶水解活力,本研究以偶氮酪蛋白为底物,对从上海地区牧场中随机挑选出的29株嗜冷假单胞菌的胞外蛋白酶水解能力和耐热性进行了定量检测,并评估了不同种假单胞菌的腐败潜力。基于rpo B基因对这29株假单胞菌在菌种层次进行种类鉴定,结果表明有14株菌属于荧光假单胞菌。分别在6℃和30℃两种培养条件下,对所有假单胞菌的蛋白酶水解活力进行定量检测,结果表明6℃下假单胞菌平均蛋白酶水解活力大小为3.46 DAh-1m L-1,30℃下假单胞菌平均蛋白酶水解活力大小为4.57DAh-1ml-1。结果还表明荧光假单胞菌的蛋白酶酶活高于其它菌株,且这些菌株胞外蛋白酶有很好的耐热性,这表明荧光假单胞菌比其他假单胞菌具有更大的腐败潜力,也表明荧光假单胞菌双重PCR检测方法建立的必要性。综上所述,本研究设计的双重PCR体系能够弥补常规PCR技术的不足,高效特异的检测出乳制品中的荧光假单胞菌,可应用于实际检测中,具备良好的应用价值。