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目的:采用Pulsinelli四血管阻断法致大鼠全脑缺血再灌注模型,并在不同时期实施鼻咽腔亚低温,观察海马CA1区细胞外液谷氨酸(Glutamic acid, Glu)浓度([Glu]e)和Bcl-2、Bax蛋白表达的变化,探讨鼻咽腔亚低温对全脑缺血再灌注损伤的脑保护时间窗。方法:1实验分组及动物模型制备Wistar雄性大鼠24只,体重250±20g(河北医科大学实验动物中心提供)。随机分为4组(每组6只),常温组(A组),缺血前降温组(B组),缺血即刻降温组(C组)和再灌注即刻降温组(D组)。腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉大鼠后,于颈后正中第一、二颈椎处切开皮肤,剥离显露双侧翼小孔.烧灼两侧的椎动脉使其闭塞。24小时候后,再次麻醉大鼠,气管插管,吸氧,保留自主呼吸。手术过程中间断给予水合氯醛维持麻醉,持续监测直肠温度。右股静脉切开置管以1ml/h的速度输入乳酸钠林格氏液。作颈前正中切开,分离出双侧颈总动脉,用4-0丝线穿过颈总动脉,备用,部分缝合颈部伤口。两侧鼻腔插入自制硅胶管并固定,深度5mm。动物立体固定后,头皮刺入电极,持续监测脑电图(EEG),四肢皮下刺入电极,持续监测心电图(ECG)。切开头皮,用微型颅钻在右侧海马CA1区([前囟,bregma]后方3.6mm和中线旁开3mm)打开一直径约2mm的圆孔,将温度探头刺入大脑皮侧2mm,同样的方法将微透析探针刺入左侧海马CA1区,以2.5μl/min的速度注入乳酸钠林格氏液,操作结束1小时脑电图波形稳定后,开始持续收集脑组织微透析液,间隔时间为10min,直至再灌注后2h。室温保持在25°C。之后按照实验分组给予不同处理。(1)常温组(A组):整个实验中保持大鼠直肠和海马温度均为37±0.5°C,动脉夹夹闭双侧颈总动脉20min再灌注。(2)缺血前降温组(B组):通过鼻腔内置入的硅胶管,输入5°C生理盐水,速度为100ml·min-1·kg-1,当海马温度降至33°C后,夹闭双侧颈总动脉20min再灌注,通过调节输入生理盐水的速度保持海马温度33±0.5°C,并维持此温1h。(3)缺血即刻降温组(C组):夹闭双侧颈总动脉同时开始鼻咽腔降温,使海马温度降至33±0.5°C,并维持1h,夹闭双侧颈总动脉20min后再灌注。(4)再灌注即刻降温组(D组):夹闭双侧颈总动脉20min后,再灌注即刻实施鼻咽腔降温至海马温度为33±0.5°C,并维持此温度1h。后三组低温结束后缓慢复温至降温前水平。以上四组均通过保温维持直肠温度37±0.5°C。2标本的采集及检测方法2.1海马CA1区细胞外液谷氨酸浓度的检测微透析液收集后保存在-70°C。利用高效毛细管电泳法测定出各种浓度的谷氨酸标准品的峰面积,并绘制标准曲线、求得回归方程。利用该方法测出每个样品中谷氨酸的峰面积,根据回归方程求得谷氨酸的浓度。2.2 Bcl-2、Bax表达的检测再灌注8h后,大鼠深麻醉经左心室-升主动脉插管,灌注生理盐水50 ml以冲洗血液,然后快速灌注4 %多聚甲醛溶液50 ml,待全身僵硬后,断头打开颅骨完整取出脑组织,浸入4 %多聚甲醛溶液中固定。Bcl-2、Bax免疫组化测定采用SP法进行,按照试剂盒要求步骤依次进行。结果:1缺血中各组间海马CA1区[Glu]e比较缺血10min,与A组、D组比较,B、C两组[Glu]e明显降低(P<0.05); B组[Glu]e低于C组(P=0.037); D组与A组比较差别无统计学意义(P>0.05)。缺血20min,与A组、D组比较,B、C两组[Glu]e明显降低(P<0.05)。A组和D组,B组和C组比较差别无统计学意义(P>0.05)。2再灌注期间各组海马CA1区[Glu]e比较再灌注后10min、20min,B、C和D组海马CA1区[Glu]e均明显低于A组(P<0.05)。与D组比较,B、C两组均明显降低(P<0.01)。再灌注后30min,B、C、D组海马CA1区[Glu]e明显低于A组(P<0.05),B、C、D三组之间两两比较差别无统计学意义(P>0.05)。3各组内海马CA1区[Glu]e恢复至缺血前水平所需时间的比较A、B、C和D四组海马CA1区[Glu]e恢复至缺血前水平所需时间分别为40min、20min、20min和30min。4各组间海马CA1区Bcl-2表达的比较与A组比较,B、C、D三组海马CA1区Bcl-2均明显升高(P<0.05);B、C、D三组两两比较差别均无统计学意义(P>0.05)。5各组间海马CA1区Bax表达的比较与A组比较,B、C、D三组海马CA1区Bax表达均明显降低(P<0.05);B、C、D三组两两比较差别均无统计学意义(P>0.05)。结论:1不同时期鼻咽腔降温对脑缺血再灌注损伤均有一定保护作用。2从谷氨酸变化观察,鼻咽腔降温实施越早,脑保护作用越显著。