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红细胞是血液细胞的重要组成部分,担负着运输氧气到肌体各种组织和细胞的重要生理功能。在胚胎与胎儿期,依次由卵黄囊、肝、脾、骨髓完成造血;出生后,骨髓成为主要的造血场所。红细胞的生成首先是由多能干细胞分化为多能髓系祖细胞,进一步分化为红系祖细胞,经历红系集落形成单位BFU-E(burst forming unit-erythroid)和红系克隆形成单位CFU-E(colony forming unit-erythroid)阶段,接着经历原幼→早幼→中幼→晚幼→网织红细胞而分化为成熟红细胞。正如其它细胞的分化过程一样,这一过程也非常复杂,并被多种因素精密调节。 造血干细胞向红系的分化决定和继续分化发育成熟是多个基因有次序地开启和关闭或表达增强和降低的结果,它们的表达异常,可能导致血液病的发生。K562细胞是从红白血病病人血液中分离出的细胞株,相当于干细胞分化过程中的红系和巨核系共同祖细胞阶段但停止继续分化。在氯高铁血红素(Hemin)诱导下可继续红系分化过程。为了进一步获得分化过程中相关基因表达的信息,我们应用改良的差异显示RT-PCR技术(DDRT-PCR),分析K562细胞在Hemin诱导的红系分化前后的基因表达变化,获得红系分化相关基因的线索,进而确定在红系分化中起重要作用的基因,并研究它们的作用机制。 通过对红系分化前后差异表达明显的电泳带进行克隆、测序及在NCBI进行BLAST比对,发现这些基因多为氧化还原酶及其它酶类、信号转导分子、分化相关分子、细胞凋亡相关分子、肿瘤相关分子、染色质结构蛋白等,还有一些已知cDNA而未知功能的基因和几个可能的新基因。为了实验DDRT-PCR差异表达的可靠性,用Dot Blot对部分差异表达带进行分析,证明了改良的DDRT-PCR技术较好地克服了假阳性率高的缺点。 我们首先选择了两个Heroin诱导后表达升高的基因进行功能研究。一个为钙依赖的磷脂酶结合蛋白Annexinl,已知它参与调节细胞生长分化、凋亡等过程。另一个为ArhGAP15,是一个新的人RhoGAP(Rho GTP酶激活蛋白),与Racl相互作用,