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大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）病严重危害全球大豆[Glycine max（L.）Merr]的产量和品质。在中国将SMV分为22个株系（SC1-SC22）,其中SC15和SC18是我国南方及黑龙江大豆产区的流行株系,且SC15能突破所有10个鉴别寄主品种的抗性,是迄今为止发现的毒性最强的SMV株系,对我国的大豆生产构成了严重威胁。培育大豆抗病品种是防治SMV最经济、环保及有效的方法,抗性遗传和抗病基因的标记定位能为大豆对SMV抗病育种提供理论指导和技术支撑。本研究的内容是:（1）通过配制不同的杂交组合,研究大豆对SMV部分株系的抗性的遗传方式及抗病基因间的等位关系;（2）利用新开发的SSR标记,对SC15和SC18的抗病基因进行精细定位;（3）预测抗病候选基因,比较抗病候选基因在亲本间的序列差异,并对抗病候选基因在SMV诱导下的表达进行分析,筛选最有可能的抗病候选基因;（4）探索H202、抗氧化酶（POD和CAT）和植物激素在抗病基因介导的抗病过程中的作用。主要结果如下:1.不同SMV株系的全基因组序列分析对致病力不同的4个SMV流行株系SC10（4050-3）、SC14（ZHZH132）、SC15（6768）和SC18（4273）进行基因组全序列测定,发现4个株系全基因组长度均为9529 nt,均包含1个开放阅读框（ORF）,且核苷酸序列同源性很高;与47个SMV相关的马铃薯Y病毒属病毒分离物的全基因组核苷酸序列比对和系统进化分析表明,这4个株系与中国SMV株系（SC3和SC6）的核苷酸序列同源性较高,且非翻译区（N-UTR）和第一蛋白（P1）基因在全基因组中表现出较高的变异性。2.抗病性遗传和抗病基因的等位性分析抗感杂交组合南农1138-2（感）×科丰1号（抗）、南农1138-2（感）×RN-9（抗）和齐黄1号（抗）×南农1138-2（感）衍生的各世代群体接种SMV株系SC18,结果显示F1代均对SC18表现抗性,说明抗性是显性遗传;F2代符合3抗:1感的分离比,F2:3代家系符合1抗:2分离:1感的分离比,说明科丰1号、齐黄1号和RN-9对SC18的抗性均由一对显性基因控制。抗抗杂交组合RN-9（抗）×科丰1号（抗）,齐黄1号（抗）×科丰1号（抗）及齐黄1号（抗）× RN-9（抗）衍生的群体接种SC18株系,F1代均表现抗性,F2代均符合15抗:1感的分离比,说明科丰1号、齐黄1号和RN-9对SC18的抗病基因独立遗传。对RN-9 × 7605组合衍生的F2群体及重组自交家系（RIL）群体接种4个株系（SCI0、SC14、SC15和SC18）。F1代均表现抗病,F2代符合3抗:1感的分离比,RIL群体符合1抗:1感的分离比,说明“RN-9”对SC10、SC14、SC15和SC18的抗性均由单显性基因控制。表型鉴定结果显示,216个RIL家系中53个家系对SC10、SC14、SC15和SC18的症状反应之间的交换率最低仅为6.48%,最高为12.50%。说明RN-9对4个株系的抗病性可能是由不同的基因控制的。3.RN-9对SC15抗病基因的精细定位及候选基因分析利用 RN-9 × 7605 衍生的 F2（n=315）和 RIL（F7:11,n=216）群体,把Rsc15定位于大豆6号染色体（C2连锁群）SSR标记Sat246和Satt286之间,与前人研究结果基本一致。又以RN-9×7605衍生的RIL群体,把RN-9对SC10和SC18的抗病基因定位于SSR标记Satt286和Satt277之间;把RN-9对SC14和SC15的抗病基因定位于标记Satt246和Satt286之间。说明RN-9在大豆6号染色体上存在一个SMV抗性基因簇。在Rsc15定位区段开发新的SSR标记,用该RIL群体把Rsc15精细定位于2个SSR标记SSR0617和BARCSOYSSR060835之间,距离两侧标记遗传距离分别为 2.38 cM 和 1.66 cM。抗病候选基因预测表明:标记Sat246和Satt286之间共有136个基因,均不属于NBS-LRR家族,但有2个编码RLK和5个编码STK的基因。标记SSR0617和BARCSOYSSR060835之间的精细定位区段约为95 kb,预测有5个基因。其中Glyma.06g182500编码未知功能蛋白,Glyma.06g182600（命名为GmPEX14）编码过氧化物酶体膜锚定蛋白,Glyma.06g182700编码碳酸酐酶涉及防止氧化损伤,Glyma.06g182800编码多肽重复类蛋白,Glyma.06g182900编码STK。对精细定位区段内和区段附近的抗病候选基因进行亲本间DNA/cDNA序列比对。精细定位区段内的5个抗病候选基因的编码序列（CDS）和基因Glyma.06g182700、Glyma.06g182800和Glyma.06g182900的启动子序列在两个亲本之间均是保守的,而在基因Glyma.06g182600（GmPEX14）的启动子序列在两个亲本之间检测到1个核苷酸插入/缺失突变（InDel;8 bp）和1个单核苷酸多态性（SNP）差异位点。此外,所有3个STK编码基因（Glyma.06g176800、Glyma.06g177700 和 Glyma.06g183300）的 CDS在两个亲本之间是保守的,而RLK编码基因Glyma.06g175100和Glyma.06g183500的CDS或启动子序列在两个亲本之间分别有3个和6个SNP,Glyma.06g184400在7605中接近起始密码子的单碱基对缺失导致转录延迟。用qRT-PCR对精细定位区段内和区段附近的抗病候选基因进行SMV诱导表达分析。定位区段内的5个基因,只有基因GmPEX14在品种RN-9接种后1-12 hpi相对7605表达上调;精细定位区段附近的12个植物免疫相关基因,在两亲本间对SMV接种后的表达谱也有一定差异。在多种胁迫（SA、JA、ABA、ET和冷害）处理后,所有RLK、STK编码基因以及基因Glyma.06g182600,在不同时间点的相对表达量均显示显著差异。组织特异性表达分析表明,这些基因在叶中的表达量高于根、茎、花和幼荚。序列和表达分析说明GmPEX14是Rsc15最有可能的抗病候选基因,并且4个RLK和STK编码基因（Glyma.06g175100、Glyma.06g182900、Glyma.06g183500 和 Glyma.06g184400）也是可能的抗病候选基因。对抗感品种接种SMV后的H2O2的含量和CAT、POD的活性进行测定。结果表明:RN-9中H2O2的含量高于南农1138-2;RN-9在2-12 hpi的H2O2的含量显著高于PBS对照。南农1138-2中的CAT活性高于RN-9,且在2 hpi和24 hpi有两个峰值。南农1138-2和RN-9之间没有检测出POD活性的显著差异。相关性分析表明,在RN-9接种SMV的早期的阶段（0-12 hpi）,GmPEX14的相对表达量与H2O2浓度和CAT/POD活性之间高度相关,说明GmPEX14可能通过调控细胞内过氧化物的平衡,参与RN-9对SC15的抗性。4.科丰1号对SC18抗病基因的精细定位及抗病候选基因分析用科丰1号×南农1138-2衍生的F2群体（n=180）和5个SSR标记（Satt698、Satt558、Satt634、Satt266和Satt537）把科丰1号对SC18的抗病基因定位于大豆2号染色体（D1b连锁群）上标记Satt634和Satt266之间,其与2个标记之间的遗传距离分别为5.5 cM和15.3 cM。在抗病基因定位区段开发新的SSR标记,用科丰1号×南农1138-2衍生的2个RIL群体,把科丰1号对SC18的抗病基因精细定位于2个SSR标记 BARCSOYSSR020667 和 BARCSOYSSR020770 之间,物理距离约为 87.3 kb,预测有6个基因。对这6个抗病候选基因的序列分析表明:基因Glyma.02G127800与受体类激酶介导的免疫共调控因子（Co-regulators of receptor kinase-mediated immunity）的系统进化关系最近,亲本间存在13个SNP位点,导致4个AA替换;Glyma.02G127900没有功能注释;Glyma.02G128000（包括Glyma.02G128100）编码S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶活性蛋白,能响应多重胁迫条件（盐,干旱和冷）,在两亲本之间保守;Glyma.02G128200编码一个假定S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶（SAM-Mtase）蛋白,是萜类和异黄酮等重要生物代谢的关键酶类,亲本间同源性为98.8%,有10个AA替换,且均位于Mtase结构域;Glyma.02G128300编码一个CDP-醇磷脂酰转移酶活性蛋白,与质膜合成相关,亲本间有4个SNP,引起CDP-APT结构域内的1个AA替换。抗病候选基因的SMV诱导表达分析表明:Glyma.02G127800在科丰1号中在2 hpi和9 hpi之间显著上调;Glyma.02G128000（包括Glyma.02G128100）在南农1138-2中仅在2 hpi表达水平显著上调;Glyma.02G128200在3 hpi显著上调,且在科丰1号中显示较早的反应;Glyma.02G128300在1 hpi均显著上调,但南农1138-2比科丰1号的相对表达量高约3倍。以上结果表明基因 Glyma.02G127800、Glyma.02G128200和Glyma.02G128300是科丰1号对SC18最可能的抗病候选基因。抗病候选基因亚细胞定位结果表明,融合蛋白Glyma.02G127800-GFP仅被定位在细胞膜上;Glyma.02G128000-GFP被定位在细胞膜、细胞质和细胞核上;Glyma.02G128300-GFP被定位在细胞膜和细胞质上,与它们的蛋白结构预测结果一致。本研究将为SC18抗病基因的克隆和分子标记辅助育种提供理论依据。