本研究工作的目的是探索制作蛋白质芯片(蛋白质微阵列)的新思路和新方法。本文首先对蛋白质芯片的发展现状进行了文献综述，并对其优势和存在的问题进行了分析。蛋白质芯片，作为高通量蛋白分析的一项关键技术，逐渐在蛋白质组研究，药物筛选以及个性化临床诊断方面凸显出重要的作用，并随着蛋白质组计划的推进，将发挥更加关键的效力。所以，现在进行蛋白质芯片的研究和开发，是非常具有现实意义和紧迫性的。 蛋白质芯片是在基因芯片基础上发展起来的一项高通量的分析技术，虽然运用了基因芯片成功的自动化点样和激光共聚焦扫描技术，蛋白质芯片在实现大规模实际应用之前依然存在三个大的瓶颈：1)如何有效地，高活性地固定蛋白探针分子，并长期保持其反应特异性；2)如何大规模制备纯化的蛋白探针分子；3)如何实现高灵敏度和无标记的蛋白质芯片检测。 本研究工作围绕解决这三个瓶颈问题引出三条研究主线，通过独立研究或者合作开发的形式，在这三个方面都取得了富有创新性的结果。 第一条主线是研究如何在固体表面进行高活性的蛋白固定。我们首先选择的基底是有机膜覆盖的硅表面。与常用的玻璃基底不同，硅具有半导体性质并能够很方便地与高速发展的微电子工艺相结合，将生命现象的复杂性与微电子的高速计算处理结合起来，同时促进两方面的发展。另外一方面，人们及我们实验室对有机膜覆盖的硅表面进行过详细的表征，能够较方便地调控表面的性质，为从化学角度进行表面分子的构筑提供了坚实的基础。 我们第一次报道了在羧基终止的硅表面成功地通过酰胺键共价固定蛋白质，并用原子力显微镜观察了表面固定蛋白的形貌，并测定了低密度下表面固定蛋白的密度。然后结合荧光标记蛋白表面固定的动力学曲线，推算出饱和状态下表面的蛋白单层密度。我们还运用荧光光谱等手段，研究了表面固定抗体蛋白的亲和性和特异性，对硅表面固定的蛋白进行了全面而细致的表征，得到了表面密度，固定动力学曲线，平衡常数等重要的参数，为今后在此表面上开展的深入研究做好了充分的准备。 在成功地在有机膜覆盖的硅表面上固定蛋白质之后，我们开始寻找新的方法提高固定蛋白的反应活性和特异性。通过实验和文献调研，我们总结出亲水且带电荷的表面适合进行共价蛋白固定，并能降低由于疏水相互作用而导致的蛋白表面变性。由于DNA是生物分子并带有净的负电荷，我们最终选择了单链DNA固定的硅表面来固定蛋白。通过比较改良前后的两种方法，DNA固定的硅表面确实能在一定程度上提高蛋白的亲和活性，并降低蛋白的非特异性吸附。改良表面固定蛋白的方法并不能彻底解决蛋白活性固定的瓶颈问题，我们从DNA芯片上得到启发，尝试通过DNA杂交来固定蛋白。首先将一段短的DNA片断偶联到蛋白探针分子上，然后这个探针分子与目标检测分子在溶液状态下进行识别反应，最后再通过DNA碱基配对杂交将捕获的分子固定在芯片的特定位置进行检测。这种方法将彻底改变蛋白质芯片制备的思路，使几乎所有活性相关的过程都在溶液环境下发生，从根本上解决蛋白表面变性的问题。为了进一步发展DNA杂交固定蛋白的方法，针对其可能出现的非匹配杂交和非特异性识别的假阳性情况，我们给体系增加荧光共振能量传递的限制因素，通过设计荧光给体和受体，使得只有在既匹配又特异识别的情况下才能使荧光受体分子发光。另一方面，我们将被动检测化为主动检测，引入了表面电位扫描的控制因素，结合本实验室在电位控制发卡型DNA探针杂交的重要成果，采用不受荧光强度波动的解链电位为参数，可特征地区分出蛋白检测的各种情况。至此，我们为解决第一个瓶颈问题提出了新的思路并取得了开创性的实验结果。 第二条主线是如何实现蛋白探针分子的高通量制备。噬菌体展示技术是近年来发展起来的高通量表达蛋白片断的技术，它通过基因融合将外源蛋白片断表达在噬菌体的外壳蛋白上。通过随机变化融合基因的碱基序列，可以得到高达1010容量的噬菌体抗体库，非常适合于用作蛋白质芯片的探针分子。我们首先研究了噬菌体在表面的共价固定，并运用原子力显微镜表征得到了清晰的噬菌体表面固定的形貌和密度，通过这些数据确定了噬菌体固定的适宜条件。我们挑选出展示了五种抗体片断的噬菌体，制备了第一个噬菌体抗体芯片，并用芯片特异地区分出正常淋巴细胞和癌变细胞的蛋白质组，证明了噬菌体抗体芯片在蛋白质组和临床检测方面的巨大潜力。为了进一步提高噬菌体抗体的特异性，我们改进了噬菌体抗体的展示方法，将pⅢ展示改进为pⅧ展示，使得抗体片断的密度提高了数十倍，并使其取向保持优化。特异性实验表明，改进后的噬菌体抗体芯片的特异性比之前提高了上千倍，完全适合于实际体系的检测和研究。这部分工作是与生命科学学院朱圣庚教授实验组合作完成的。 另外，围绕第二条主线，我们还尝试了采用抗体的模拟分子适体Aptamer来进行蛋白质芯片的研究。适体是一段小的核酸片断，可以是RNA也可以是DNA，它们同样可以形成一定的三维结构与小分子或蛋白特异结合，并表现出极高的特异性。我们将适体固定在基底表面，成功地在单片和微阵列两个尺度都实现了特定蛋白的检测。这种方法为降低制作成本，在一定程度下取代抗体来制备蛋白质芯片提供了好的思路。 第三条主线是如何实现无标记高灵敏度的检测。全反射红外技术是一项高灵敏度的表面微量物质检测技术，不仅能提供表面物质含量的信息，甚至可以研究表面分子的状态和相互作用，因此我们尝试将其应用扩展到生物传感乃至生物芯片的领域。我们经过两年的努力，自行设计并搭建了全反射红外装置，这套装置的特色在于其晶体可以方便地进行表面修饰和反应。运用这套装置我们研究了重氮树脂逐层组装的规律(与曹维孝教授实验室合作)，实现了DNA杂交效率的无标记测量，实现了无标记的适体传感器对凝血酶的检测，还用全反射红外的方法研究了寡聚酰胺在双链DNA中的嵌入以及光引发切割剂的效果评估(与袁谷教授实验室合作)。初步证明，全反射红外技术在生物传感领域有着极大的应用潜力。