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为了探究miR-16-5p在乳腺癌中的表达及作用,笔者进行以下几个方面的研究:一、乳腺癌组织中miR-16-5p、HIF-1α、VEGF的表达及其与患者临床病理学特征的关系;二、上调miR-16-5p的表达对乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231细胞生物学行为的影响;三、miR-16-5p对HIF-1α、VEGF转录后调控的作用机制研究。 第一部分 乳腺癌组织中miR-16-5p、HIF-1α、VEGF的表达及其与患者临床病理学特征的关系 方法: 1.采集郑州大学第一附属医院乳腺外科74例手术切除乳腺癌组织及相对应的癌旁正常乳腺组织标本。 2.采用Agilent miRNA芯片技术检测3例乳腺癌组织及相对应的癌旁正常乳腺组织标本中miRNA的表达情况。 3.运用荧光定量PCR检测74例样本中miR-16-5p和HIF-1α、VEGF mRNA的表达。 4.采用Western Blot技术检测HIF-1α和VEGF的蛋白表达情况。 5.分析miR-16-5p、HIF-1α、VEGF mRNA的表达与乳腺癌患者性别、年龄、组织学分级、TNM分期和有无淋巴结转移之间的关系。 6.采用SPSS21.0.软件进行统计分析,检验水准a=0.05。 结果: 1.经Agilent miRNA芯片检测分析,在乳腺癌组织中共有86个miRNAs表达异常,其中46个上调,40个下调。miR-16-5p在乳腺非特殊型浸润性癌中呈高表达。 2.qRT-PCR结果显示,miR-16-5p在乳腺癌组织中的表达较正常乳腺组织显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05); 3.qRT-PCR结果显示,HIF-1α、VEGF在乳腺癌组织中的mRNA水平表达量均显著高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。 4.Western blot结果显示,HIF-1α、VEGF在乳腺癌组织中的蛋白水平表达量均显著高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。 5.乳腺癌组织中miR-16-5p以及HIF-1α与VEGF的mRNA表达水平与患者的组织学分级、TNM分期及淋巴结转移密切相关(P均<0.05); 结论: 1.在乳腺癌组织中,miR-16-5p表达水平较正常乳腺组织显著降低,提示其可能在乳腺癌中发挥抑癌基因的作用。 2.miR-16-5p可能参与乳腺癌的发生发展过程,且可能与HIF-1α和VEGF的表达密切相关。 第二部分 上调miR-16-5p的表达对乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231细胞生物学作用的影响 方法: 1.采用Real-time PCR检测乳腺癌细胞中miR-16-5p在不同乳腺癌细胞株MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,MDA-MB-468,T47D以及正常乳腺细胞MCF-10A中的表达。 2.慢病毒感染MCF-7、MDA-MB-231细胞,筛选得到稳定表达miR-16-5p的细胞株,采用实时定量PCR检测慢病毒感染后MCF-7、MDA-MB-231细胞中miR-16-5p的表达。 3.本实验分为三组:实验组(重组miR-16-5p慢病毒感染细胞),空白组(未处理的MCF-7和MDA-MB-231细胞)和阴性对照组(miR-NC慢病毒感染细胞)。 4.本课题采用CCK-8法、平板克隆形成实验对各组细胞增殖和生长能力进行检测。 5.AnnexinⅤ-APC/PI双标记流式细胞术、Hoechst染色法对各组细胞的凋亡情况进行检测。采用侵袭实验对各组细胞的侵袭转移能力进行检测。 6.裸鼠移植瘤实验检测miR-16-5p过表达对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤的影响,并采用免疫组织化学检测HIF-1α和VEGF蛋白的表达。 结果: 1.miR-16-5p在MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,MDA-MB-468,T47D乳腺癌细胞株中mRNA水平较MCF-10A的表达均有所下降,且差异有统计学意义(P<0.05),其中以MCF-7和MDA-MB-231下降最为显著。 2.成功构建含miR-16-5p序列的慢病毒载体,稳定高表达组中LV1-miR-16-5p在MCF-7中的表达量约为空白细胞组的6.41倍,在MDA-MB-231中的表达量约为空白细胞组的4.56倍。 3.通过CCK-8法检测,结果表明miR-16-5p组与空白对照组和阴性对照组相比,吸光度减少显著。平板克隆形成实验结果表明miR-16-5p组细胞克隆形成数较无关对照组和空白对照组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。 4.AnnexinⅤ-APC/PI双标记流式细胞术和Hoechst染色检测显示重组miR-16-5p慢病毒感染后MCF-7和MDA-MB-231细胞的凋亡率较空白对照组与阴性对照组显著升高。 5.侵袭实验发现,MCF-7实验组穿膜细胞数为(49.0±5.1)个,相比于空白对照组和阴性对照组穿膜细胞数明显减少,有显著的统计学差异(P<0.05)。MDA-MB-231实验组穿膜细胞数为(42.0±7.1)个,与空白对照组和无关对照组相比显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。 6.裸鼠移植瘤实验表明实验组肿瘤组织体积和正常对照组相比明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。瘤组织免疫组化结果显示,实验组Hif和VEGF表达较正常对照组和阴性对照组明显减少。 结论: 1.成功建立了过表达miR-16-5p的乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞株。 2.体外上调乳腺癌细胞中miR-16-5p表达可有效抑制肿瘤细胞的生长、降低其侵袭能力,促进细胞的凋亡。动物实验表明miR-16-5p过表达能有效抑制裸鼠移植瘤生长。 第三部分 miR-16-5p对HIF-1α、VEGF转录后调控作用机制的初步研究 方法: 1.通过生物信息学分析预测miR-16-5p的下游靶基因。 2.设计靶向HIF-1α和VEGF的siRNA序列,转染至MCF-7、MDA-MB-231细胞。分为以下几组:未转染的MCF-7、MDA-MB-231细胞(Blank组)、miR-16-5p慢病毒感染的MCF-7、MDA-MB-231细胞(miR-16-5p组)、HIF-1αsiRNA干扰表达的MCF-7、MDA-MB-231细胞以及VEGF siRNA干扰表达的MCF-7、MDA-MB-231细胞。通过qRT-PCR、Western blot检测各组细胞Hif/VEGF mRNA和蛋白表达,CCK-8法检测各组之间细胞增殖,AnnexinⅤ-APC/PI双标记流式细胞技术检测各组之间的凋亡情况,侵袭实验检测各组之间的侵袭能力。通过western blot的方法检测不同HIF-1α和VEGF以及miR-16-5p表达对乳腺癌细胞增殖,凋亡以及侵袭等相关蛋白的影响。 3.构建表达载体pcDNA3.1-HIF-1α、pcDNA3.1-VEGF,通过回复实验分析miR-16-5p对HIF-1α和VEGF生物学活性的调控。 结果: 1.HIF-1α和VEGF是miR-16-5p的预测靶基因。 2.MiR-16-5p不改变HIF-1α和VEGF的转录水平,但显著影响其蛋白的水平,但siRNA干扰后,其HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白表达显著下调。 3.HIF-1α和VEGF的过表达明显恢复miR-16-5p过表达细胞系MCF-7和MDA-MB-231中HIF-1α和VEGF蛋白的表达。 4.HIF-1α和VEGF过表达能够明显逆转miR-16-5p过表达对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞的促凋亡情况。 5.HIF-1α和VEGF过表达后,乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的侵袭能力显著增高,且能够明显逆转miR-16-5p过表达对乳腺癌侵袭能力的抑制作用。 6.miR-16-5p的过表达与HIF-1α和VEGF的沉默能协同性降低细胞的侵袭能力,促进细胞的凋亡,同时转染后,BAD,BAX,和cleaved caspase3的表达显著上升,MMP-9,p-AKT以及HIF-1α的表达均显著降低。 结论: 1.miR-16-5p通过HIF-1α和VEGF发挥抑制乳腺癌的作用。 2.操纵miR-16-5p可能成为未来乳腺癌潜在的分子治疗靶点。 全文结论: 1.乳腺癌组织中,miR-16-5p表达水平较正常组织显著降低。其表达水平与患者的淋巴结转移、分化程度以及TNM分期有关。 2.体外上调乳腺癌细胞中miR-16-5p的表达可有效抑制细胞的生长、降低细胞侵袭能力,并且促进细胞的凋亡。动物实验表明miR-16-5p过表达能有效抑制裸鼠移植瘤生长。 3.miR-16-5p是通过调控靶基因HIF-1α和VEGF的表达发挥抗肿瘤作用。 4.miR-16-5p发挥抑癌作用,有望成为乳腺癌基因治疗新的靶点。