论文部分内容阅读
近年来,WSSV感染致病率有所下降,但是WSSV感染在一定条件下仍然是对虾养殖的主要威胁,因此研究对虾抗WSSV治疗及其机理具有重要意义。肽聚糖对对虾的免疫效果较低,同样siRNA干扰也不能有效抵抗WSSV感染和发病,其免疫保护也较低。试验设计在强化免疫条件下,WSSV感染后发病状况变化,再利用siRNA干扰技术,观察对虾WSSV感染后,其保护率的变化,期望探讨对虾抗病毒免疫机理和抗WSSV的治疗技术,并为在亲本的有效实用的病毒防治上提供技术与理论基础。本实验的主要内容有以下三个方面。(1)利用超声波溶解从溶藻弧菌细胞壁中提取出的肽聚糖,注射到凡纳滨对虾肌肉内,再感染WSSV。在不同时间点记录凡纳滨对虾死亡数,试剂盒法测定对虾免疫学指标。(2)确定vp28-siRNA干扰WSSV最佳浓度,在凡纳滨对虾感染WSSV第24h时,把最佳浓度的vp28-siRNA注射到凡纳滨对虾,利用半定量PCR和荧光定量检测在不同时间点确定siRNA干扰效果。(3)凡纳滨对虾在注射肽聚糖后,感染WSSV,不同时间点注射vp28-siRNA,检测对虾免疫保护率。基于上面的实验设计,采集五个不同实验组对虾的肝胰腺进行转录组测序和分析。具体研究结果与分析如下:1.实验验证WSSV病毒毒性,接着凡纳对虾分别注射0.05mg/m L(PSA组)、0.1mg/mL(PSB组)和0.15mg/mL(PSC组)的肽聚糖,进行免疫刺激24h后感染WSSV,测定其免疫保护率和肝胰腺、血清中的免疫学指标。实验结果表明:超低温保存的WSSV粗提液在对虾体内复活后重新提取的粗提液,经PCR检测显示WSSV呈阳性;注射到凡纳滨对虾体内,第1天后出现大量死亡数;对死亡对虾PCR检测,结果显示WSSV呈阳性,证明WSSV具有较强的感染性。与对照组相比,PSA组的保护率为36.67%,PSB组为46.67%,PSC组为56.67%;对虾的保护率随着肽聚糖的浓度增大而增大。凡纳滨对虾血清中的PO酶活的情况如下:PSA组在72h时达到最大值,PSB组在48h时达到最大值,PSC组也在24h时达到最大值。同时,实验组对虾肝胰腺中的ACP、AKP、SOD和NOS酶活与对照组相比,有极显著性的差异(P<0.01)。PSA组ACP在24h时达到最大值,AKP在第12h时达到最大值,SOD在48h时达到最大,NOS在24h时达到最大值;PSB组ACP、AKP和SOD都在48h时达到最大值,NOS在12h时达到最大值,但在96h时又有一个高峰;PSC组ACP和AKP在24h时达到最大值,SOD在12h时达到最大值,之后逐渐减少,在72h时又达到一个高峰,NOS在第6h时达到最大值,之后逐渐减少。2.确定了siRNA最佳浓度为0.1μg/μL,每尾注射100μL时,干扰效果是最好,同时得到其保护率为40%。荧光定量检测凡纳滨对虾体内病毒拷贝数,结果表明在第48h时能很好干扰WSSV病毒复制,干扰效果呈现持续到第120h。3.0.1mg/m L肽聚糖对凡纳滨对虾进行免疫24h,感染WSSV之后不同时间点注射vp28-siRNA的实验结果显示:6h注射组的保护率为80%,12h注射组为63.33%,24h注射组为56.67%。保护率比单注射siRNA或肽聚糖的保护率高。4.采集五个组的肝胰腺进行了转录组测序和分析。通过Illumina Hiseq2000平台测序,总计产出24,001,958,340nt数据。组装结果总Unigene35,274个,总长38,807,225nt,平均长度1,100nt,N50达到2,012nt。差异表达基因分析结果所示:BSA组与P6A组比较,上调基因13344,下调943,说明注射了肽聚糖和vp28-siRNA的效果非常明显。通过差异表达基因的通路富集分析,P6A组与BSA、WSA、PWA和WRA组相比,分别在内吞作用、溶酶体、通路有显著性富集。