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随着糖尿病发病率的增加，糖尿病肾病(DN)的发病率也呈逐年上升趋势。DN是引起终末期肾脏病的重要原因，导致极高的致死率和致残率，然而目前尚缺乏有效防治手段。因此，寻找有效防治DN的新方法至关重要。氧化应激是DN的重要发病机制。高血糖状态下，肾脏活性氧簇(ROS)产生增多，超过了机体抗氧化防御系统的清除能力，通过多种途径诱导DN的发生、发展。核因子相关因子2(Nrf2)在机体抗氧化系统中起到核心作用。作为转录因子，Nrf2可进入细胞核，结合下游抗氧化基因启动子区的抗氧化反应元件(ARE)，启动这些基因的转录，从而减轻糖尿病引起的氧化应激损伤，延缓DN的病情进展。姜黄素是天然植物提取物，对多种疾病模型具有良好的保护作用，然而其生物利用率低，极大地限制了它的临床应用。在DN动物模型中姜黄素的有效剂量为50-200mg/kg，每日一次；而新型姜黄素同源物C66的有效剂量仅为5mg/kg，隔日一次，与天然姜黄素相比生物利用率显著提高，具有良好的临床应用前景。然而，C66对DN的保护作用机制尚不明确。我们之前的研究显示C66可显著上调主动脉Nrf2表达，减轻糖尿病引起的大血管病变。为了探讨C66是否通过上调肾脏Nrf2减轻DN，我们在C57BL/6J野生型及C57BL/6J Nrf2敲除小鼠中采用多次小剂量腹腔注射链脲佐菌素的方法诱导糖尿病模型，成模的同时给予C66处理，5mg/kg，隔日一次，持续6个月。结果显示，在野生型小鼠中，C66可显著减轻糖尿病小鼠蛋白尿和肾脏纤维化；而Nrf2敲除部分减弱了C66对DN的保护作用。这些结果一方面证实了C66通过上调Nrf2对DN起重要保护作用；另一方面提示除上调Nrf2外，仍有其他作用机制参与C66对DN的保护作用。本研究的第二个目的是探讨C66上调Nrf2的机制。在胞浆中，肌动蛋白结合蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)结合Nrf2，阻止Nrf2入核启动下游抗氧化基因的转录，并介导Nrf2的泛素化降解。因此，下调Keap1是上调Nrf2的有效策略。研究表明，微小RNA-200a (miR-200a)可结合Keap1mRNA的3’非翻译区，导致Keap1mRNA降解，最终引起Keap1蛋白水平降低。另有研究表明，姜黄素可上调miR-200a。因此，我们假设C66通过上调miR-200a，降低Keap1水平，进而上调Nrf2。为了验证该假设是否成立，我们在野生型糖尿病小鼠中同时应用C66和miR-200a的特异性抑制剂-锁核苷酸修饰的抗miR-200a (LNA-200a)干预6个月。结果显示C66可显著上调肾脏miR-200a、降低Keap1mRNA及蛋白水平、上调Nrf2蛋白水平及其下游抗氧化基因血红素加氧酶1(HO1)、醌氧化还原酶-1(NQO1)的mRNA水平；而LNA-200a的应用完全阻断了C66的这些作用。这些结果证实C66通过上调miR-200a进而激活Nrf2。本研究的第三个目的是寻找并探讨除上调Nrf2外，C66保护DN的其他机制。在DN相关的microRNA中，姜黄素除上调miR-200a外，尚可下调miR-21水平；且miR-21在DN的发病机制中起重要作用。miR-21可结合并降解Smad7的mRNA，导致Smad7蛋白水平下调，进而引起其下游致纤维化转录因子Smad3活化，诱导糖尿病肾脏纤维化。因此，我们假设C66通过下调miR-21减轻DN。我们首先在野生型小鼠中观察C66对miR-21和miR-21基因转录初级产物pri-miR-21的影响，结果显示C66在非糖尿病及糖尿病肾脏中均可显著下调miR-21及pri-miR-21的水平。这些结果肯定了C66对miR-21的下调作用，并揭示了C66对miR-21的下调作用发生在转录水平，而非miR-21的转录后加工过程。为明确C66对Smad7/Smad3信号通路的影响，我们进一步检测了Smad7的mRNA和蛋白水平，以及磷酸化Smad3(p-Smad3)的蛋白水平。结果提示C66在非糖尿病与糖尿病肾脏中均可上调Smad7表达、下调p-Smad3的蛋白水平。为进一步排除Nrf2的影响，我们在Nrf2敲除糖尿病小鼠中分别给予C66和miR-21的特异性抑制剂LNA-21（阳性对照）处理6个月，结果显示C66和LNA-21相似程度地降低了肾脏miR-21的表达，减轻了糖尿病引起的蛋白尿及肾脏损伤。这些结果证实除上调Nrf2以外，C66可通过抑制miR-21减轻DN。综上所述，本研究首次阐明了新型姜黄素同源物C66减轻DN的双重作用机制：上调Nrf2和抑制miR-21。此外，本研究进一步阐明了C66通过上调miR-200a从而活化Nrf2的机制。