论文部分内容阅读
目的：休克是由于组织灌流不足引起的代谢和细胞受损的病理过程，而液体复苏是治疗失血性休克的重要措施之一。许多证据显示，HMGB1分子是参与炎症反应的重要介质，它不仅是当初报道的，脓毒症巨噬细胞释放的晚期介质，也是一种警报素，作为早期介质，参与了创伤、失血性休克等非感染性炎症的发生。同时，越来越多的报道显示去乙酰化酶SIRT1参与炎症反应的调控，缓解缺血再灌注和脓毒症等诱发的多脏器损伤。然而，SIRT1对于HMGB1的去乙酰化调控少见报道，SIRT1-去乙酰化HMGB1信号通路具体到休克这一特殊疾病模型中的研究则相对空白。希望在既往研究的基础上，从SIRT1对于HMGB1的去乙酰化调节着手，查明HMGB1的乙酰化在重症失血性休克发生中的作用。
方法：本研究分为临床、动物和细胞三个部分。A.在临床研究中收集18名失血性休克患者不同时间点的外周血，检测血清中HMGB1的含量，并与同期健康志愿者相对比;同时，对18名失血性休克患者进行APACHEII评分，Speannan法分析其分值与HMGB1含量峰值的秩次关系。B.在动物研究中采用96只大鼠复制失血性休克.再灌注损伤(HS/R)模型，检测不同时间点的大鼠血清及各实质脏器中HMGB1的水平，并选取最具代表性的时间点(4h)及器官(。肾脏)作为后续研究;检测HS/R后4h时肾脏中HMGB1的核浆分布情况及乙酰化水平;检测HS/R后大鼠。肾小管上皮细胞中SIRT1的表达和活性，以及与HMGB1的相互作用水平;HMGB1中和抗体与PD对照检测失血性休克后大鼠HMGB1、炎性因子及SIRT1的影响;检测激活SIRT1后对HMGB1核浆分布及乙酰化水平的影响;从整体水平上检测激活SIRT1后对大鼠的肾功能、凋亡水平以及整体生存时间的影响。C.细胞学实验中采用HK-2模型，首先探查了不同缺氧-复氧(H/R)时间对细胞活力的影响;检测H/R后细胞中HMGB1的核浆分布和乙酰化水平;检测H/R后细胞中SIRT1的表达和活性，以及与HMGB1的相互作用水平;瞬时转染的方法在HK-2细胞中过表达SIRT1和SIRT1H363Y(一种突变体，其中SIRT1的脱乙酰酶结构域中的关键组氨酸被酪氨酸残基H363Y替代)，并与正常对照组做对比，以此判断SIRT1对HMGB1的调控水平是否取决于SIRT1的去乙酰化活性;继而采用小干扰RNA技术，检测干扰sin1后对H/R刺激后的HK-2细胞中HMGB1的核浆分布及细胞培养上清中含量的影响;采用公司合作设计五个HMGB1赖氨酸残基位点(K28、K29、K30、K90、K177)的乙酰化抗体，以检测SIRT1去乙酰化HMGB1的具体修饰位点;检测PD对H/R后HK-2细胞SIRT1的激动作用，并检测激活SIRT1后对HMGB1核浆分布及乙酰化水平的影响。
结果：A部分.临床部分研究，发现急性失血性休克患者血清中的HMGB1在4h时达到峰值371.6±69.4(ng/mL)，此后逐渐回落;而患者血清HMGB1峰值数与APACHEⅡ评分的秩次呈正相关关系，Spearman相关系数r2=0.76。B部分.动物学实验部分，在HS/R后2h，测定了肾、肝、肺、肠组织中的HMGB1的含量均有下降，为了集中探讨脏器中HMGB1的释放与血清中含量变化的关系，选择了病理变化较为明显的肾脏作为研究的对象。4h肾脏组织中的HMGB1总量较Sham组有较大程度的下降，下降了94.6±11.8(ng/mL)，而血清中HMGB1在4h时较Sham组有较大程度的上升，上升了290.4±13.3(ng/mL);在HS/R早期，肾脏总体HMGB1含量减少，与之相反的是细胞浆中HMGB1含量反而增加，而乙酰化水平也有很大程度的增加;在失血性休克后的大鼠。肾小管上皮细胞中，SIRT1表达有所下降，而SIRT1的活性有着更为明显的下降，同时，SIRT1与HMGB1的相互作用增强;采用HMGB1中和抗体虽然可以降低HS/R后大鼠血清中HMGB1的含量及部分炎性因子的水平，然而无法阻止其实质器官细胞中广泛存在的HMGB1核浆移位现象，也无法阻止其释放本身的过程，采用虎杖苷则可以有效逆转;PD能够增加HS/R后大鼠肾脏中的SIRT1表达，并且更能显著改善SIRT1活性;激活SIRT1后，作为警报素的HMGB1乙酰化程度大大减少，并且更多的保留在实质细胞内(在血清中游离的HMGB1减少);同时，激活SIRT1后，大鼠的肾小管凋亡、肾功能都得到了改善，生存时间得到延长。C部分.细胞学实验部分，在缺氧6h，复氧2h条件下，HK-2细胞的HMGB1乙酰化水平升高，存在HMGB1由胞核向胞浆，继而向培养液上清移位;当受到缺氧-复氧刺激后，HK-2细胞的SIRT1表达有所下降，而SIRT1的活性有着更为明显的下降，同时，SIRT1与HMGB1的相互作用增强;突变的SIRT1H363Y与野生型SIRT1相比，增加了SIRT1蛋白表达，但SIRT1H363Y不能降低H/R后HK-2细胞中HMGB1乙酰化水平及其向培养液中释放，而野生型过表达SIRT1降低了细胞中HMGB1的释放;用空载体的Con-Si和Sirt1-Si对比，后者有更加明显的增多，其中赖氨酸残基的K90、K177两个位点的乙酰化的变化尤明显;PD能够增加缺氧-复氧刺激的HK-2细胞中的SIRT1表达，并且更能显著改善SIRT1活性;SIRT1的激活抑制了缺氧-复氧刺激的HK-2细胞中HMGB1由胞核-胞浆-上清移位。
结论：1.失血性休克病人在休克后4h血清中的HMGB1达到了峰值，而峰值数值越高，死亡风险越高。
2.失血性休克早期时血清HMGB1的升高与它从肾脏等实质脏器细胞中的释放有关，乙酰化促使HMGB1从胞核移位到胞浆，随后主动释放到细胞外。
3.休克时SIRT1活性(去乙酰化作用)下降，引起HMGB1乙酰化增强，促使其从细胞核移位至胞浆，以及最后的释放。
4.SIRT1与HMGB1有细胞内有天然的相互作用(免疫共沉淀)，其主要作用是HMGB1赖氨酸残基的K90、K177位点。
5.失血性休克HMGB1的早期释放带来全身炎症反应和局部脏器的损伤，给予SIRT1的激活剂(PD、SRT1720)可提高肾脏SIRT1的活性，降低HMGB1的乙酰化水平，减少肾脏凋亡和恢复肾功能，延长失血性休克动物的存活时间，因此找到了一个拈抗和调控HMGB1的新靶点，即激活SIRT1，这为重症休克的治疗提出了新的思路。
方法：本研究分为临床、动物和细胞三个部分。A.在临床研究中收集18名失血性休克患者不同时间点的外周血，检测血清中HMGB1的含量，并与同期健康志愿者相对比;同时，对18名失血性休克患者进行APACHEII评分，Speannan法分析其分值与HMGB1含量峰值的秩次关系。B.在动物研究中采用96只大鼠复制失血性休克.再灌注损伤(HS/R)模型，检测不同时间点的大鼠血清及各实质脏器中HMGB1的水平，并选取最具代表性的时间点(4h)及器官(。肾脏)作为后续研究;检测HS/R后4h时肾脏中HMGB1的核浆分布情况及乙酰化水平;检测HS/R后大鼠。肾小管上皮细胞中SIRT1的表达和活性，以及与HMGB1的相互作用水平;HMGB1中和抗体与PD对照检测失血性休克后大鼠HMGB1、炎性因子及SIRT1的影响;检测激活SIRT1后对HMGB1核浆分布及乙酰化水平的影响;从整体水平上检测激活SIRT1后对大鼠的肾功能、凋亡水平以及整体生存时间的影响。C.细胞学实验中采用HK-2模型，首先探查了不同缺氧-复氧(H/R)时间对细胞活力的影响;检测H/R后细胞中HMGB1的核浆分布和乙酰化水平;检测H/R后细胞中SIRT1的表达和活性，以及与HMGB1的相互作用水平;瞬时转染的方法在HK-2细胞中过表达SIRT1和SIRT1H363Y(一种突变体，其中SIRT1的脱乙酰酶结构域中的关键组氨酸被酪氨酸残基H363Y替代)，并与正常对照组做对比，以此判断SIRT1对HMGB1的调控水平是否取决于SIRT1的去乙酰化活性;继而采用小干扰RNA技术，检测干扰sin1后对H/R刺激后的HK-2细胞中HMGB1的核浆分布及细胞培养上清中含量的影响;采用公司合作设计五个HMGB1赖氨酸残基位点(K28、K29、K30、K90、K177)的乙酰化抗体，以检测SIRT1去乙酰化HMGB1的具体修饰位点;检测PD对H/R后HK-2细胞SIRT1的激动作用，并检测激活SIRT1后对HMGB1核浆分布及乙酰化水平的影响。
结果：A部分.临床部分研究，发现急性失血性休克患者血清中的HMGB1在4h时达到峰值371.6±69.4(ng/mL)，此后逐渐回落;而患者血清HMGB1峰值数与APACHEⅡ评分的秩次呈正相关关系，Spearman相关系数r2=0.76。B部分.动物学实验部分，在HS/R后2h，测定了肾、肝、肺、肠组织中的HMGB1的含量均有下降，为了集中探讨脏器中HMGB1的释放与血清中含量变化的关系，选择了病理变化较为明显的肾脏作为研究的对象。4h肾脏组织中的HMGB1总量较Sham组有较大程度的下降，下降了94.6±11.8(ng/mL)，而血清中HMGB1在4h时较Sham组有较大程度的上升，上升了290.4±13.3(ng/mL);在HS/R早期，肾脏总体HMGB1含量减少，与之相反的是细胞浆中HMGB1含量反而增加，而乙酰化水平也有很大程度的增加;在失血性休克后的大鼠。肾小管上皮细胞中，SIRT1表达有所下降，而SIRT1的活性有着更为明显的下降，同时，SIRT1与HMGB1的相互作用增强;采用HMGB1中和抗体虽然可以降低HS/R后大鼠血清中HMGB1的含量及部分炎性因子的水平，然而无法阻止其实质器官细胞中广泛存在的HMGB1核浆移位现象，也无法阻止其释放本身的过程，采用虎杖苷则可以有效逆转;PD能够增加HS/R后大鼠肾脏中的SIRT1表达，并且更能显著改善SIRT1活性;激活SIRT1后，作为警报素的HMGB1乙酰化程度大大减少，并且更多的保留在实质细胞内(在血清中游离的HMGB1减少);同时，激活SIRT1后，大鼠的肾小管凋亡、肾功能都得到了改善，生存时间得到延长。C部分.细胞学实验部分，在缺氧6h，复氧2h条件下，HK-2细胞的HMGB1乙酰化水平升高，存在HMGB1由胞核向胞浆，继而向培养液上清移位;当受到缺氧-复氧刺激后，HK-2细胞的SIRT1表达有所下降，而SIRT1的活性有着更为明显的下降，同时，SIRT1与HMGB1的相互作用增强;突变的SIRT1H363Y与野生型SIRT1相比，增加了SIRT1蛋白表达，但SIRT1H363Y不能降低H/R后HK-2细胞中HMGB1乙酰化水平及其向培养液中释放，而野生型过表达SIRT1降低了细胞中HMGB1的释放;用空载体的Con-Si和Sirt1-Si对比，后者有更加明显的增多，其中赖氨酸残基的K90、K177两个位点的乙酰化的变化尤明显;PD能够增加缺氧-复氧刺激的HK-2细胞中的SIRT1表达，并且更能显著改善SIRT1活性;SIRT1的激活抑制了缺氧-复氧刺激的HK-2细胞中HMGB1由胞核-胞浆-上清移位。
结论：1.失血性休克病人在休克后4h血清中的HMGB1达到了峰值，而峰值数值越高，死亡风险越高。
2.失血性休克早期时血清HMGB1的升高与它从肾脏等实质脏器细胞中的释放有关，乙酰化促使HMGB1从胞核移位到胞浆，随后主动释放到细胞外。
3.休克时SIRT1活性(去乙酰化作用)下降，引起HMGB1乙酰化增强，促使其从细胞核移位至胞浆，以及最后的释放。
4.SIRT1与HMGB1有细胞内有天然的相互作用(免疫共沉淀)，其主要作用是HMGB1赖氨酸残基的K90、K177位点。
5.失血性休克HMGB1的早期释放带来全身炎症反应和局部脏器的损伤，给予SIRT1的激活剂(PD、SRT1720)可提高肾脏SIRT1的活性，降低HMGB1的乙酰化水平，减少肾脏凋亡和恢复肾功能，延长失血性休克动物的存活时间，因此找到了一个拈抗和调控HMGB1的新靶点，即激活SIRT1，这为重症休克的治疗提出了新的思路。