拟穴青蟹(Scylla paramamosain)，简称青蟹，是我国东南沿海重要的经济养殖蟹类。迄今已有报道抗菌肽在青蟹抵抗海洋环境中病原微生物的入侵感染方面具有重要作用。抗菌肽广泛存在于自然界的生物中，是动物先天性免疫系统中的重要组分。自1996年甲壳类抗菌肽首次在岸蟹（Carcinus maenas）中报道以来，已有几种抗菌肽在蟹类血淋巴系统和生殖系统中被发现，它们是蟹类重要的免疫因子。因此，青蟹中新抗菌肽的揭示对于深入阐明其免疫机制及其在复杂的环境中健康生存具有重要的科学意义和应用价值。本实验室在前期研究中筛选到一个新的与蛛型互爱蟹(Hyas araneus)Hyastatin同源性较高的基因序列，进一步分析发现其为一种新的抗菌肽并命名为SpHyastatin。本文对SpHyastatin的表达特性、基因调控、抗菌活性与机制以及细菌感染后的保护力等进行了深入研究，具体研究结果如下:　　1.阐明了青蟹SpHyastatin的编码序列和基因组结构。通过RACE技术及序列拼接获得777 bp的全长SpHyastatin cDNA序列(GenBank登录号:JX228177)，其中开放阅读框编码131个氨基酸。序列分析发现，SpHyastatin的编码区由信号肽、N端脯氨酸富集区(proline-rich domain，PRD)以及C端半胱氨酸富集区(cysteine-rich domain，CRD)组成。基因组全长1488 bp，包括两个外显子和一个内含子(741 bp)，内含子中含有TAG或GAA三碱基多次重复的微卫星序列。　　2.揭示了SpHyastatin在正常组织、不同发育阶段、不同类型血淋巴细胞中的表达特性。SpHyastatin在血淋巴细胞中表达量最高，其次为甲壳下皮层，其它组织器官中表达微弱。检测三种青蟹血淋巴细胞，SpHyastatin在半颗粒细胞中转录丰度最高。在胚胎发育早期阶段（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）表达水平较低，从胚胎Ⅴ期至大眼幼体期表达量显著升高。同时与已知6种抗菌肽基因进行表达分析，发现SpHyastatin在青蟹大眼幼体、仔蟹(10-20mg)、仔蟹(40±5g)和成蟹(300 g)等四个不同发育阶段中始终保持高水平的表达，预示该抗菌肽可能在整个发育过程中都发挥着重要的作用。　　3.检测了脂多糖（lipopolyaccharides，LPS）刺激和副溶血弧菌感染后青蟹SpHyastatin基因在不同组织器官中的表达特性。LPS刺激12h后，SpHyastatin基因在青蟹免疫器官（血淋巴细胞、鳃）和消化器官（中肠）中都呈下调表达，分别为对照组的0.36、0.18和0.35倍(P＜0.05)。随刺激时间延长，SpHyastatin基因的表达水平逐渐升高，48 h在中肠及96 h在血淋巴细胞和鳃中表达量最高。与LPS刺激相似，副溶血弧菌感染24 h后SpHyastatin基因在血淋巴细胞和中肠中的转录水平显著下降，分别为对照组的0.38和0.17倍(P＜0.05)，感染96 h后转录水平显著上升，分别为对照组的6.07倍(P＜0.05)和6.10倍(P＜0.01)，但在鳃中呈现出不同的表达变化趋势。　　4.分析发现NF-κB结合位点是SpHyastatin启动子区域中关键的转录调控元件。通过基因步移技术扩增获得576 bp SpHyastatin基因上游调控序列，利用双荧光素酶报告系统及鲤鱼上皮瘤细胞(endothelial progenitor cells，EPC)和人宫颈癌细胞(human cervical cancer cells，Hela)研究其转录调控机理。检测结果显示，当删除SpHyastatin5侧翼-107 bp至-69 bp区域后，重组子pGL-69/+33的相对荧光强度显著下降，分析发现-107 bp至-69 bp区域中存在假定NF-κB结合位点。与pGL3-567/+33转录活性相比，NF-κB结合位点的三碱基突变和删除突变重组子的转录活性显著下降，表明该结合元件对SpHyastatin的转录起正调控作用。此外，LPS可显著增强SpHyastatin基因启动子的转录活性，但对NF-κB结合位点突变的重组子无明显诱导作用，提示LPS可能通过NF-κB结合位点调控SpHyastatin基因的转录。本试验将有助于深入研究LPS刺激引起抗菌肽基因的表达变化机制。　　5.阐明SpHyastatin的抗菌活性和抗菌功能域。利用获得的毕赤酵母（Pichiapastoris）表达产物SpHyastatin和PRD进行抗微生物活性检测。研究发现，SpHyastatin表达产物具有广谱抗菌活性，对溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus Fleming)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）等革兰氏阳性菌以及荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等革兰氏阴性菌均具有较强的抑杀作用（0.63-10μmol/L）。杀菌动力学曲线显示，SpHyastatin与金黄色葡萄球菌共孵5h能够杀死近90％的细菌，共孵6h杀菌指数可达到100％。PRD能够有效抑制金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌、施氏假单胞菌以及荧光假单胞菌的生长(MIC=2.5-5μmol/L)。而CRD只对荧光假单胞菌、藤黄微球菌、谷氨酸棒杆菌具有微弱的抑菌活性(MIC=25-37μmol/L)，说明其抗菌活性部位主要在PRD。　　6.揭示SpHyastatin对不同种类的病原菌具有不同的抗菌机理。ELISA分析结果显示，SpHyastatin蛋白在浓度为1.25μg/mL时即可结合LPS与脂磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA); Western-blot结果表明SpHyastatin和PRD具有几丁质结合活性，而CRD无此功能;碘化丙啶(propidium iodide，PI)摄取试验结果显示，与SpHyastatin蛋白孵育2h后，几乎所有的微生物细胞均具有红色荧光信号，表明其细胞通透性发生改变;扫描电子显微镜(scanning electronmicroscope，SEM)图片显示，SpHyastatin蛋白处理后的金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌以及毕赤酵母的细胞膜表面变得粗糙，细胞结构遭到严重破坏;采用共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）观察蛋白与微生物互作后的定位情况，结果发现在金黄色葡萄球菌和毕赤酵母中，SpHyastatin蛋白能够定位于细胞膜，细胞质无荧光信号，而在荧光假单胞菌的细胞膜和细胞质中均能检测到SpHyastatin蛋白。　　7.青蟹活体试验证明SpHyastatin可提高青蟹的存活率。用SpHyastatin表达产物单独注射青蟹1h，后再经副溶血弧菌感染192 h，发现该抗菌肽可显著提高青蟹的存活率(P＜0.05);此外，SpHyastatin表达产物与副溶血弧菌共注射青蟹120 h，发现SpHyastatin可延迟青蟹的死亡，青蟹的半数致死时间可从10h延迟到30h，表明SpHyastatin具有免疫保护作用。　　8.在细菌感染下SpHyastatin的存在会影响其它免疫基因的表达水平。研究发现，青蟹注射副溶血弧菌后，其Toll通路的相关基因(Spaetzle、SpToll、Cactus、Dorsal、Relish)、抗氧化酶相关基因(SOD、CAT、GPx)及Lysozyme表达水平显著升高，而SpHyastatin与副溶血弧菌共注射于青蟹，上述基因的表达会显著的降低。此外，病原菌感染青蟹后抗菌肽Crustin和ALF2基因的表达量较PBS组显著下降，而SpHyastatin与副溶血弧菌共注射后，则两种基因下调的幅度减小。SpHyastatin蛋白单独处理组几乎不能引起上述所有基因的表达变化。