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新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感是养禽业必须预防和控制的三种重要疫病。新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起,近年来在我国主要流行的是基因Ⅶ型强毒株;鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的急性、高度接触性传染病;H9亚型禽流感在我国家禽中广泛存在,传播效力高,传播速度快,是目前最难控制的禽流感之一。为了抵御这三种疾病的侵害,降低单价苗频繁免疫接种带来的副反应,研制免疫效力优、交叉保护性好的鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感(H9亚型)三联灭活苗是必要的。本研究通过反向遗传技术构建了 4株重组H9亚型禽流感病毒(AIV),分别制成单价灭活苗,比较免疫后抗体水平及攻毒保护情况;选取免疫原性较好的AH515-PR8株与NDV(A-Ⅶ株)、IBV(QXL87株)制成三联灭活疫苗,并将该疫苗与市售同类产品进行免疫效力的比较。1.重组H9亚型AIV的构建利用反向遗传技术,以H1N1流感病毒A/Texas/05/2009×Puerto Rico/8/1934的六个内部基因为骨架,构建了含4株H9N2亚型AIV流行株的囊膜糖蛋白(HA、NA)基因的重组病毒A3-PR8、AH515-PR8、TM343-PR8与XZ349-PR8。将4株重组病毒在鸡胚上进行连续传代,其中A3-PR8株、AH515-PR8株与TM343-PR8株均能在鸡胚中稳定生长,红细胞凝集价达到29及以上。分别对4株重组病毒E6代次的病毒含量进行测定,与对应的原始毒株进行比较,发现重组毒株的病毒含量提升0.5～0.8个滴度。2.重组H9亚型AIV疫苗候选株的免疫原性评价试验分为A3-PR8组、AH515-PR8组、TM343-PR8组、疫苗株WJ57-PR8组和攻毒对照组,各免疫组采用21日龄SPF鸡10只,攻毒对照组采用21日龄SPF鸡5只。各免疫组分别以颈部皮下注射的方式免疫,每只鸡0.2mL(含2×108.5EID50病毒);攻毒对照组接种等量PBS。免疫后第7、14、21、28天采血,测定血清中H9亚型AIV的血凝抑制(HI)抗体效价。结果表明,AH515-PR8组在免疫后抗体水平不断上升,且一直高于其它免疫组;免疫后28d,抗体效价最高,为28.9,高出其余组0.4～0.7个滴度。在攻毒后,AH515-PR8组、TM343-PR8组与疫苗株WJ57-PR8相比,排毒量有明显下降。其中AH515-PR8组排毒量最低,5d时病毒分离率为0%。3.新支流三联灭活疫苗免疫效力评价将50只SPF鸡随机分为免疫组A1组、B1组、A2组与B2组,每组各10只;攻毒对照A3组与B3组,每组各5只。A1、B1两组于21日龄免疫新支流三联灭活疫苗,含3.5×108EID50 NDV、4×106EID50 IBV、5.8×108EID50AIV;A2、B2 两组免疫市场同类产品。免疫后7d、14d、21d、28d采血分离血清,使用HI试验测定NDV与AIV的抗体效价,使用ELISA试验测定IBV的抗体水平。结果显示,免疫后28d,NDV抗体均值达到29.3,比同类产品高出1个滴度;AIV抗体均值为210.2,比同类产品组高出0.7个滴度;IBV抗体免疫后7d时均为阴性;14d时A1组抗体阳性率为80%,比B1组高出10%;21d、28d时两组抗体阳性率均为100%。使用NDV JS02/06株对A1、A2、A3组通过滴鼻点眼的途径攻毒,使用H9亚型AIV WJ57株对B1、B2、B3组通过翅静脉注射的途径攻毒。攻毒后于3、5、7d采集喉头与泄殖腔拭子测定排毒。在NDV部分,A1组临床保护率为100%,比A2组高出10%,同时大幅降低NDV的排毒,在攻毒后7d病毒分离率为10%。在AIV部分,B1组3d时排毒率为20%,5d时排毒率为0%,均低于B2组。综上所述,本研究构建了 4株重组H9亚型AIV A3-PR8、AH515-PR8、TM343-PR8与 XZ349-PR8,其中 AH515-PR8 株免疫原性最佳。AH515-PR8 株与 NDV(A-Ⅶ株)、IBV(QXL87株)制成三联灭活疫苗后均展现了良好的免疫保护效果,为研制商品化的新支流三联灭活疫苗奠定基础。