目的:1.从中医学“痰瘀”的角度,评估抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的临床疗效及相关数据,为抗纤软肝颗粒抗肝纤维化提供最新的循证医学证据。2.基于网络药理学运用网络数据挖掘技术筛选抗纤软肝颗粒治疗肝纤维化活性成分,并对成分作用潜在靶点与机制进行整合与分析,探究抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的药理学机制,为抗纤软肝颗粒抗肝纤维化提供科学依据,以及为后续实验研究提供一定基础。3.通过细胞实验与动物实验,基于肝窦毛细血管化,探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的作用机制。方法:1.采用临床回顾性对照研究的方法,从“痰瘀”的角度,研究抗纤软肝颗粒对痰瘀互结型肝纤维化患者临床疗效。将60例慢性乙型肝炎（CHB）肝纤维化患者,分为2组:治疗组患者利用抗纤软肝颗粒联合恩替卡韦（entecavir,ETV）治疗,对照组仅予ETV抗病毒治疗。治疗6个月,比较治疗前后中医证候积分、血清部分肝功能指标、血清肝纤维化及肝脏弹性等指标变化情况。2.采用网络药理学的研究方法,借助Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine（BATMAN-TCM）结合DisGeNET,Genecard,HPO,OMIM疾病靶点数据库,通过构建抗纤软肝颗粒活性成分作用靶点网络与肝纤维化疾病相关靶点网络相互映射来挖掘抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用靶点,利用STRING进行生物过程和通路富集分析,探究抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的通路研究。3.分别采用细胞实验与动物实验的方法:（1）细胞实验中,采取二次重复给药的方式,通过Wistar雄性大鼠制备和提取抗纤软肝颗粒和对照组含药血清,分别处理原代肝窦内皮细胞模型。采用Western-blotting方法检测肝窦内皮标志物分化抗原簇31（CD31）和血管性血友病因子（vWF）的蛋白表达水平,分析抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞分子水平的影响;采用免疫组织化学的方法检测细胞中CD31、vWF细胞因子表达水平;通过扫描电镜检测肝窦内皮细胞窗孔的变化。（2）动物实验中,通过CCl₄--橄榄油混合溶液皮下注射与低蛋白高脂饲料喂养Wistar雄性大鼠诱导肝纤维化动物模型,运用拆方研究的方法,以索拉非尼作为对照药物,研究抗纤软肝颗粒（母方,MF）、母方去鳖甲方（QJ）和鳖甲（BJ）对肝纤维化大鼠一般情况、血清肝功能、肝组织和血清MMP13和TIMP-1分子、肝组织病理学、肝组织肝窦毛细血管化、肝组织肝窦毛细血管化分子水平的影响。另外,对肝组织中NO、NOS、MDA、T-SOD和HYP分子进行测量,观察抗纤软肝颗粒组及其拆方各组对肝组织细胞膜脂质过氧化和酶促防御系统的影响的影响,进而观察其对肝窦毛细血管化的影响。采用生化检测大鼠血清部分肝脏功能ALT、AST、ALB、IgG水平;采用qRT-PCR方法检测大鼠肝组织中MMP-13、TIMP-1和VEGF的mRNA表达水平;采用Western-blotting方法检测肝组织中CD31、vWF、CollagenⅠ和CollagenⅣ的蛋白表达水平;分别采用H&E染色和天狼星红染色检测肝大鼠肝组织病理变化;通过扫描电镜检测大鼠肝组织肝窦内皮细胞窗孔及基底膜的变化;用ELISA法检测大鼠血清中MMP-13、TIMP-1的表达水平;采用生化检测方法检测大鼠肝组织NO、NOS、MDA、T-SOD和HYP指标。结果:1.临床研究结果:抗纤软肝颗粒对慢性乙型肝炎（CHB）肝纤维化痰瘀互结型患者临床研究共收集病例60例,其中男29例,女31例,年龄18-65岁,平均52.5岁,治疗组32例,对照组28例。（1）两组病例在性别、年龄、肝纤维化程度、治疗前主要症状和舌脉积分分布等方面行x²检验,差异无统计学意义（P>0.05）。（2）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者临床症状总疗效的影响,结果显示:与对照组相比,治疗组总有效率（84.375%vs60.7 1%）、显效率（53.125%vs28.57%）,差异具有显著统计学意义（P<0.05）。（3）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者症候积分的影响及单项症状总有效率比较,结果显示:治疗前两组比较,治疗组与对照组的中医证候积分（23.40±4.14vs22.80±3.85,t=0.5786,P>0.05）;治疗后两组比较,治疗组与对照组的中医证候积分（8.75±3.28vs15.84±4.24,t=7.2916,P<0.01）。两组治疗前后组内比较,治疗后治疗组与对照组中医证候积分均较治疗前下降,差异有显著统计学意义（t=15.6901,P<0.01）。两组对肝纤维化单项症状积分总有效率影响,与对照组比较,治疗组各项单项症状总有效率均显著增高,差异有显著统计学意义（t=11.406,P<0.01）。与对照组相比,抗纤软肝颗粒联合ETV治疗组能显著减轻患者临床症候:右胁隐痛、腹胀、乏力、纳差、便溏、舌暗红/淡暗、苔白腻、脉滑涩等。（4）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者部分肝功能指标的影响,结果显示:对照组与治疗组在治疗前后进行组内比较,两组ALT、AST、TBIL、GGT各项指标治疗后均较治疗前下降明显,差异有显著统计学意义（P<0.01）。另外,治疗后两组间比较,治疗组较对照组指标下降幅度更为明显,差异有显著统计学意义（P<0.05）。（5）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者肝纤维化指标的影响,结果显示:两组治疗前后进行组内比较,两组HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN指标治疗后均较治疗前下降,差异有显著统计学意义（P<0.01）。治疗后两组组间比较,治疗组较对照组指标下降幅度更为明显,差异有显著统计学意义（P<0.01）。（6）抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者肝脏弹性的影响,结果显示:两组治疗前后进行组内比较,可见对照组治疗前后指标比较差异无统计学意义（P>0.05）,而治疗组在治疗前后比较,肝脏硬度指标明显下降,差异有显著统计学意义（P<0.01）。另外,两组治疗后组间比较,治疗组较对照组明显降低肝脏硬度指标,差异有显著统计学意义（P<0.01）。2.网络药理学分析结果:在Batman-TCM中输入抗纤软肝颗粒的7种药物,分别搜索到鳖甲1个,丹参39个,地骷髅2个,莪术6个,海藻1个,牡蛎5个,生山楂30个化合物信息,共计84个。通过DisGeNET,Genecard,OMIM,HPO检索并筛选821个肝纤维化疾病相关的靶点,整合筛选出抗纤软肝颗粒成分和肝纤维化交集关键靶点。利用Cytoscape3.7.1软件构建成分-靶点-疾病网络,以大于平均自由度为筛选条件筛选出核心网络,获得95个抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的相关靶点。通过STRING的GO功能和途径/通路富集分析得到2203条生物过程,181个分子功能和包括MAPK、JAK-STAT、PI3K-AKT、Toll受体等在内的162条KEGG通路,这些通路为抗纤软肝颗粒在临床中的使用提供更为有力的、可靠的药理学证据。3.实验研究结果:实验一:基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的细胞实验研究,结果显示:（1）抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞中形态的影响:肝窦内皮细胞经经免疫荧光单标、荧光显微镜观察鉴定。倒置相差显微镜下观察,与对照血清组（Control组）比较,抗纤软肝颗粒含药血清组（MF组）肝窦内皮细胞形态学无明显变化。（2）抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞窗孔结构的影响:对照组肝窦内皮细胞窗孔狭小,窗孔结构将近闭塞,数量较少,而抗纤软肝方组可见肝窦内皮细胞窗孔结构清晰,窗孔增多增大,明显可见。（3）抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞CD31和vWF细胞因子的影响:抗纤软肝颗粒组原代肝窦内皮细胞CD31、vWF细胞因子的表达水平较对照组明显降低,差异有显著统计学意义（CD31:0.0688±0.0150vs0.1151±0.0114,t=4.2565,P<0.05;vWF:0.0920±0.0089vs0.1319±0.0135,t=4.2740,P<0.05）。（4）抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞CD31、vWF蛋白表达的影响:与对照组相比,抗纤软肝颗粒组原代肝窦内皮细胞CD31、vWF的蛋白表达水平明显降低,差异有显著统计学意义（CD31:0.3337±0.0290vs0.4480±0.0128,t=6.2454,P<0.01;vWF:0.5603±0.0472vs0.7093±0.0448,t=3.9658,P<0.05）。实验二:基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的动物实验研究,结果显示:（1）抗纤软肝颗粒对大鼠一般情况的影响:造模组体重增长受到抑制,其它治疗组大鼠体重均有增加。与模型组比较,抗纤软肝颗粒母方组大鼠体重明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。母方组肝纤维化死亡率和腹水发生率明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。肝脏指数和脾脏指数各组比较无明显统计学差异（P>0.05）。（2）抗纤软肝颗粒对大鼠肝功能的影响:经抗纤软肝颗粒组及其拆方各组治疗后血清ALT、AST、IgG水平显著下降,而血清ALB的水平显著上升,差异有显著统计学意义（P<0.05）。（3）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织及血清MMP13、TIMP-1分子的影响:分别用qRT-PCR和ELISA法测定后显示,抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可降低肝组织TIMP-1的mRNA表达水平和血清TIMP-1分子水平,而升高肝组织MMP13的mRNA表达水平和血清MMP13的分子水平,差异有显著统计学意义（P<0.01）。与Sor组比较,母方组可明显调节肝组织和血清MMP13、TIMP-1的表达水平,差异有显著统计学意义（P<0.05）。（4）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织病理学的影响:H&E染色中,抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可明显改善大鼠肝组织病理变化、肝细胞变性坏死程度、抑制肝组织内结缔组织增生,尤其是母方组。与Sor组相比,母方组（MF组）肝纤维化改善程度更为明显。在天狼星红染色中,与模型组比较,抗纤软肝颗粒组及其拆方各组纤维组织成分含量明显减少,母方组纤维组织含量降低最为明显。（5）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织肝窦毛细血管化的影响:与模型组相比,抗纤软肝颗粒及其拆方各组肝组织,尤其是抗纤软肝颗粒组可见肝细胞索和肝窦结构较清晰,肝窦沟可显现,肝窦扭曲、狭窄程度明显减轻,甚至消失,基底膜较薄或不连续,有的肝窦结构接近正常,肝窦壁内皮细胞窗孔明显可见,与Sor组相比,母方组大鼠肝组织可见肝窦扭曲、狭窄程度改善最为显著。（6）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织肝窦毛细血管化分子水平的影响:抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可显著降低VEGF的mRNA表达水平,与Sor组比较,抗纤软肝颗粒组差异有统计学意义。抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可显著降低CD31、vWF、CollagenI、CollagenIV的蛋白水平,尤其是抗纤软肝颗粒组。与Sor组比较,抗纤软肝颗粒对于降低CD31、vWF、CollagenI、CollagenIV的蛋白水平效果更为显著,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织中NO、NOS、MDA、T-SOD和HYP分子的影响:抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可显著降低MDA、NO、NOS和HYP表达水平,而升高T-SOD表达水平,差异具有统计学意义。与Sor组比较,母方组可明显调节MDA、T-SOD、NO、NOS和HYP的表达水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.对于治疗CHB肝纤维化痰瘀互结证,抗纤软肝颗粒联合ETV与单用ETV治疗比较,两组均显示一定疗效,均可改善患者临床证候、肝功能和肝纤维化指标。对单用ETV对照组比较,抗纤软肝颗粒联合ETV治疗组对于改善肝纤维化患者临床证候,部分肝功能和肝纤维化指标有明显优势,尤其在改善肝脏硬度方面。抗纤软肝颗粒在肝纤维化“痰瘀互结”证的治疗中起到明显软坚消痰、活血化瘀的抗肝纤维化作用。2.通过网络药理学预测分析发现抗纤软肝颗粒作用肝纤维化的相关机制可能跟MAPK、PI3K-AKT、JAK-STAT、Toll样受体等信号通路密切相关,抗纤软肝颗粒具有抗肝纤维化的药理学依据。3.细胞实验与动物实验研究结果表明,抗纤软肝颗粒对体外原代肝窦内皮细胞和体内大鼠肝纤维化组织肝窦毛细血管化有积极的治疗作用。同时,动物实验中发现,中药复方抗纤软肝颗粒、去鳖甲方与鳖甲均具有明显的抗肝纤维化作用,尤其是母方（抗纤软肝颗粒）疗效最佳。抗纤软肝颗粒对肝纤维化的作用机制,可能是通过抑制肝窦毛细血管化而防治肝纤维化。