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精原细胞经过减数分裂后生成圆形精子细胞,再经变态发育,最终成为成熟精子,在变态发育过程中,染色质高度固缩,转录活性逐渐降低,并伴随细胞质的大量丢失,导致精子细胞内RNA含量极少。目前,精子内种类繁多的RNA成分虽已被检测证实,但精子是否存在转录活性仍存在较大争议,因此,研究精子变态前后转录表达趋势具有重要意义。本实验室前期对模式动物小鼠精子发育过程的转录表达进行了研究,通过高通量测序发现在圆形、长形精子细胞和成熟精子间存在大量差异表达基因,且通过荧光定量PCR验证了结果的可靠性。对于荷斯坦牛精子发育过程中的转录表达是否和啮齿动物有相同的变化趋势,其与体细胞的差异性仍需进行深入研究。本实验采集了荷斯坦牛睾丸及附睾组织,在前期小鼠实验基础上,通过延长组织块平衡和切片染色时间及加大激光能量及频率等条件优化,建立了合适的荷斯坦牛睾丸组织冰冻切片制作、染色及激光显微切割捕获体系。通过优化后的体系共捕获了90 576个圆形精子细胞、122 651个长形精子细胞及67 818个精原干细胞样品(每样品各三个生物学重复),并通过精子浮游法获得107个附睾尾精子,为后续研究提供了可靠的实验材料。由于精子难以裂解、RNA含量低,且制备难度大,本研究比较了两种试剂盒及Trizol法三种RNA制备方法的制备效果,发现RNeasy Kit的RNA制备效率高且效果稳定(单个精子RNA含量为0.023~0.025 pg),可以用于后续高通量测序RNA样品的制备。并采用PicoPureTMRNA Isolation Kit进行了圆形、长形精子细胞及精原干细胞的RNA制备。在进行精子RNA制备时,采用的体细胞裂解液进行了白细胞、上皮细胞等体细胞的去除,并利用白细胞和上皮细胞的特异表达基因CD45和CDH1及持家基因GAPDH(跨内含子设计引物)进行反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测体细胞及基因组污染,以确保后续高通量测序的RNA样品质量。另外,本研究通过大量细胞样本,测算了单个生精细胞RNA含量,单因子方差分析结果显示,圆形精子细胞、长形精子细胞、附睾尾精子及精原干细胞RNA含量有显著差异,不但二倍体细胞(精原干细胞)和生殖细胞间存在显著差异(P<0.05),随着精子细胞的变态发育,其RNA含量逐渐减少,精子细胞圆形和长形精子细胞中RNA含量分别为附睾尾精子的752和413倍。采用Smart-seq2方法对各级生精细胞cDNA进行微量扩增,并检测其cDNA量及完整性,各样品cDNA含量均高于20 ug,且在1~2 kb间均有目的产物,完整性较好,符合建库要求。本研究根据牛睾丸组织特点建立了的冰冻切片方法和细胞取样技术体系,并获得了大量圆形、长形精子细胞和精原干细胞样品;同时得到了高效的精子RNA制备方法,并获得了变态期间的单细胞RNA含量及变化趋势;另外通过微量cDNA扩增获得了足够量且完整的cDNA,为精子RNA高通量测序奠定了基础,同时也为精子发生与变形机理研究提供了重要参考。