奶牛乳腺健康是牛奶生产的关键问题,监测乳腺的健康状况对于奶牛场经济来说是非常重要的。奶牛乳腺炎症是最普遍的生产疾病,但它会通过降低乳产量和质量,奶牛福利,生育力甚至寿命严重影响奶牛场收入。炎症发生时乳腺内的免疫应答是反映炎症阶段的重要指示。因此,通过了解奶牛乳腺对炎症的免疫应答过程,进而及时掌握奶牛乳腺健康状态,可以改善牛奶生产质量并降低乳腺炎症的治疗成本。试验一、牛奶体细胞分型检测在奶牛早期乳腺炎症评估中的应用本试验旨在通过研究奶牛不同乳腺健康状态下牛奶体细胞分型特点进而评估奶牛乳腺健康状况以及泌乳性能变化。选择102头荷斯坦奶牛进行牛奶样品采集,并检测SCC、奶产量和乳成分。根据SCC检测结果将这102份奶样分为三组,低SCC组(SCC<100,000个/mL)、中等SCC组(SCC:100,000~400,000个/mL)和高SCC组(SCC>400,000个/mL)。通过流式细胞仪对奶样中的体细胞进行分选,检测淋巴细胞,巨噬细胞和多形核嗜中性白细胞(PMN)的比例。采用标准平板计菌法对奶样品的菌落总数进行计数,并通过细菌常规鉴定法及PCR技术对奶样中的细菌种类进行分类鉴定。结果表明:1)低SCC组中,SCC在13,000~76,000个/mL范围内时,淋巴细胞的平均百分比为89.43%,是健康乳腺中的主要细胞群,当SCC增加到76,000~100,000个/mL范围内时,随SCC增加,PMN比例显著增加(P<0.01),达到79.68%,逐渐成为乳腺内主要细胞群体,据此推测早期炎症已经开始发生。SCC>200,000个/mL时,PMN的比例与SCC成正相关(r=0.3604);淋巴细胞比例与SCC呈负相关(r=-0.3207);巨噬细胞与SCC无明显相关性(r=-0.1672)。2)鉴别出的主要病原体有金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)、无乳链球菌等;次要病原体有绿脓杆菌、芽孢杆菌、乳酸乳球菌等。与细菌培养阳性样品(24.91-37.63%)相比,培养结果呈阴性的牛奶样品中平均淋巴细胞比例(58.48%)显著升高(P<0.01)。PMN比例在细菌培养阳性的奶样(38.90~55.96%)中显着高于培养阴性奶样(17.23%)(P<0.01),其中,PMN的平均百分比在主要病原体与次要病原体之间也存在显著差异(P<0.05)。3)与健康组相比,细菌培养阳性的奶样中,感染传染型病原体的奶牛,奶产量显著下降(P<0.01),酪蛋白数量及乳糖含量明显减少(P<0.05);总蛋白,酪蛋白、αs1-酪蛋白及β-酪蛋白含量显著下降(P<0.05)。在细菌培养阴性奶样中,中等至高SCC奶样中观察到酪蛋白与蛋白质比例和乳糖含量显着差异(P<0.05)。由此可见,牛奶体细胞分型检测能够从奶牛乳腺中三种主要的免疫细胞(淋巴细胞、巨噬细胞和PMN)在乳腺内部的炎症反应及免疫过程中发挥的重要的作用这一层面,更为详细的判断奶牛乳腺健康程度以及乳成分的变化的真实状况。特别是在具有极低SCC奶样中,能够检测到早期炎症的发生。因而,可以作为详细评估奶牛乳腺健康状况的新参数。试验二、乳蛋白差异性表达水平在奶牛早期乳腺炎症评估中的应用本试验基于Label free非标记定量蛋白质组学技术,分析奶牛不同乳腺健康状态下乳清中表达蛋白质的差异性。根据试验一的样品检测结果,将乳样品分为7组,分别为健康(牛奶,SCC<100,000细胞/mL,未培养)组、细菌培养阳性(具有传染型,环境型和机会型乳房内感染的培养阳性样品)组和细菌培养阴性(培养阴性-低SCC组,培养阴性-中等SCC组和培养阴性-高SCC组)组。对不同组的乳清样品中的蛋白质表达差异进行鉴定。结果表明:1)乳腺的健康状态与特异性蛋白质的存在或不存在无关,但主要涉及蛋白质的表达水平。2)总共鉴定出692种表达蛋白,其中有58种蛋白质显示出显著调节变化。与细菌培养阴性乳清样本相比,细菌培养阳性乳清样本中有20种表达蛋白显著上调,而上调蛋白质的功能多数与特异性免疫反应有关。其中一些显著上调表达的急性期蛋白可作为乳腺内感染(IMI)的诊断标志物。另外38种显著下调的表达蛋白中,多数蛋白功能与免疫保护无关,而与其他生物学功能相关,例如脂质代谢、乳糖合成、乳汁分泌以及在慢性炎症中对免疫细胞(T淋巴细胞、嗜中性粒细胞等)的诱导趋化作用。3)有21种仅在培养阳性乳清样本中鉴定到的菌体蛋白,这些菌体蛋白的存在一方面验证了细菌培养鉴定结果,另一方面,从菌体蛋白特性和功能角度,阐明了病原微生物诱发炎症的分子机制。本试验从蛋白质组成变化的角度揭示了不同乳腺健康状态下乳腺内的生物学现象,并为检测炎症乳样提供了潜在的生物标记物。综上所述,奶牛不同乳腺健康状态下牛奶体细胞分型检测与乳蛋白差异表达的研究,一方面为及时发现奶牛早期和亚临床乳腺炎症的发生提供了方法,另一方面为诊断乳腺炎症提供了潜在生物标记物。