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纳米二氧化硅(silicon dioxide, SiO2)由于其独特的理化性质被广泛应用于涂料、化妆品、催化剂、建筑材料、生物医学等多个领域,人群职业暴露的机会不断增加,其生物安全性仍不明确。近年来动物实验表明,纳米Si02短期暴露可引起严重的肺部炎症乃至动物死亡,长期暴露则可致肺纤维化。因其纤维化的机制尚不完全清楚,且人群多为低剂量长期暴露,是否可引起肺纤维化尚未有足够的证据,所以揭示纳米Si02致肺纤维化发生的分子机制可以其慢性、亚慢性毒性评价提供科学依据,也可其致肺纤维化作用提供早期敏感标志物及有效作用靶点。肺纤维化是一类由多种病因引起的肺组织损伤、肺泡结构破坏、成纤维细胞聚集、细胞外基质沉积及肺组织结构异常重塑的不可逆性疾病。肺泡Ⅱ上皮细胞可通过上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)转变为成肺成纤维细胞／肌成纤维细胞,是肺纤维化发生发展的重要细胞生物学事件。游离Si02、博来霉素、百草枯、放射性物质所致肺纤维化及特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)均被证实与EMT相关,纳米Si02致肺纤维化的过程也可能发生EMT. EMT的发生与多种细胞生长因子如转化生长因子-β(Transforming Growth Factor beta, TGF-β)、纤维母细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor, IGF)、结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor、CTGF)等密切相关,TGF-β被认为是EMT最关键的诱导因子。TGF-βⅢ型受体(TGF-βreceptor type Ⅲ, TGF-β R Ⅲ)是TGF-β通路的辅助受体,与TGF-β有很高的亲和力,其功能是通过与TGF-p结合后将TGF-p传递给TGF-β R Ⅰ和TGF-β R Ⅱ从而增强TGF-β信号通路。纤维母细胞生长因子7 (Fibroblast Growth Factor 7, FGF7)是FGF家族中重要的一员,在急性肺损伤中具有促进肺泡上皮细胞增生、分化的作用。TGF-β R Ⅲ及FGF7的过表达与肺纤维化中EMT的发生有关。微小RNA(microRNAs, miRNAs)作为重要的转录后调控因子近年来被证实与多种肺纤维化疾病密切相关,miRNAs是EMT主要的中控因子,在EMT发生发展中起重要作用。本课题组前期的研究表明,纳米Si02经气管一次性灌注后可致大鼠肺损伤,染尘7d、15d、30d主要表现为间质性肺炎,染尘60d、90d主要表现为肺间质纤维化；高通量测序结果表明miR-541是纳米Si02染尘60d、90d大鼠肺组织中表达下调的miRNA,推测miR-541可能通过调控EMT在纳米Si02致大鼠肺间质纤维化中发挥作用。为阐明miR-541在纳米Si02致大鼠肺纤维化中的生物学作用及明确miR-541与TGF-β信号通路、EMT关系,本研究将从整体动物和体外细胞两个水平来探讨其分子机制,实验结果如下：1.用TargetScan数据库对miR-541进行靶基因预测,结果显示预测靶基因共83个。用GO和KEGG数据库对83个预测靶基因进行基因富集和信号通路分析发现,miR-541在TGF-β受体信号通路和细胞分化的调控比较显著。根据本课题组前期的病理结果及上述生物信息学分析结果,本研究将TGF-β R Ⅲ、FGF7确定为miR-541重要的预测靶基因；miR-541可通过调控TGF-β受体信号通路和FGF通路在肺泡上皮细胞的分化过程中发挥作用。2. RT-qPCR结果显示,在纳米Si02染尘7d、15d、30d、60d、90d大鼠肺组织中miR-541及E-cad mRNA的表达水平与对照组比较均显著下调(差异倍数≤-2),随染尘时间延长呈下调趋势(P<0.05),60d、90d分别较7d、15d、30d显著下调,差异有统计学意义(P<0.05);FGF7 mRNA在各染尘时间点的表达与对照组比较均显著上调(P<0.05),TGF-β1、TGF-β R Ⅲ和COL Ⅲ mRNA在60d、90d显著上调(JP<0.05)；α-SMA mRNA在染尘30d、60d、90d显著上调(P<0.05):TGF-βR Ⅲ、FGF7、TGF-β1、α-SMA、COL Ⅲ mRNA的表达水平随染尘时间变化均呈上调趋势(P<0.05),60d、90d分别较7d、15d、30d显著上调,差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果表明,E-cad蛋白的表达水平在染尘60d、90d与对照组比较显著下调(P<0.05),随染尘时间延长呈下调趋势(P<0.05),60d、90d分别较7d、15d、30d显著下调,差异有统计学意义(P<0.05); TGF-β RⅢ、FGF7、TGF-β1、α-SMA、COL Ⅲ蛋白的表达水平在染尘30d、60d、90d与对照组比较均显著上调(P<0.05),60d、90d分别较7d、15d、30d显著下调,差异有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶报告基因试验结果显示,将TGF-βR Ⅲ、FGF7 3’UTR野生型的双荧光素酶报告载体分别与miR-541 mimic、mimic NC共转染A549细胞后,荧光素酶活性水平与mimic NC组比较显著降低,报告相对荧光值分别为(65±9嬲、(35±4)%,差异有统计学意义(P<0.05)；将位点突变后的双荧光素酶报告载体再分别与miR-541 mimic、mimic NC共转染A549细胞后,报告相对荧光值分别为(99±14)%、(90±3)%,与mimic NC组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。上述结果提示TGF-βRⅢ和FGF7是miR-541的靶基因,miR-541通过直接靶向调控TGF-β RⅢ和FGF7从而发挥其生物学作用。3.用5ng/ml的TGF-β1诱导48h后,可观察到A549细胞由上皮样向成纤维细胞样转变,RT-qPCR及Western Blot结果表明,与对照组比较,miR-541,E-cad mRNA及其蛋白质表达水平均显著下调(差异倍数≤-2),α-SMA、COL Ⅲ、TGF-βR Ⅲ、FGF7 mRNA及其蛋白质表达水平均显著上调(P<0.05)；采用受体阻断剂(receptor blocker, RB)诱导3h后再经TGF-β1诱导48h后未观察到A549细胞的形态学发生改变,RT-qPCR及Western Blot结果表明,E-cad、α-SMA、COL Ⅲ mRNA及其蛋白的表达水平无明显变化,miR-541、TGF-βR Ⅲ、FGF7 mRNA的表达亦无明显改变(P>0.05)。miR-541 mimic、mimic NC、miR-541 inhibitor和inhibitor NC分别转染A549细胞24h再经5ng/ml TGF-β1诱导48h后,与对照组比较,细胞的增殖率分别为(115±7)%、(106±3)%、(97±8)%、(103±3)%,差异均无统计学意义(P>0.05),镜下均未观察到A549细胞的形态学发生改变；但RT-qPCR及Western Blot结果表明miR-541 inhibitor转染组A549细胞中miR-541、E-cad mRNA与蛋白表达均显著下调,(τ-SMA、COL Ⅲ、TGF-βR Ⅲ及FGF7 mRNA与蛋白质的表达水平均显著上调(P<0.05)。miR-541 mimic转染组A549细胞中miR-541显著上调,TGF-βR Ⅲ mRNA、FGF7 mRNA及其蛋白质表达水平均下调,E-cad, α-SMA和COL Ⅲ mRNA及蛋白质的表达水平均无明显变化；mimic NC转染组和inhibitor转染组A549细胞中miR-541, TGF-βR Ⅲ FGF7、 E-cad、α-SMA和COL Ⅲ mRNA及蛋白质表达水平均无明显变化(P>0.05)。结果表明TGF-β1可抑制miR-541的表达从而促进EMT的发生,过表达的miR-541有减弱TGF-β及FGF通路的作用,进而抑制EMT的发生。综上所述,纳米SiO2致大鼠肺纤维化的过程中发生了EMT、TGF-βR Ⅲ和FGF7是miR-541的靶基因。miR-541与TGF-β通路有密切的关系,TGF-β1可抑制miR-541的表达从而促进EMT的发生。过表达miR-541也可通过抑制TGF-βR Ⅲ及FGF7的表达,减弱TGF-β及FGF通路,进而抑制EMT的发生,可能具有抑制肺纤维化的作用。