[研究背景]卵巢癌是妇科常见的三大恶性肿瘤之一,早期病情隐匿,诊断困难,多数患者就诊时已属晚期,死亡率居妇科恶性肿瘤首位。卵巢癌细胞具有较强的恶性生物学行为,易出现盆腹腔内广泛的种植转移,然而对卵巢癌的发病及恶性生物学行为机制尚不明确。因此揭示卵巢癌的发生发展机制,寻找新的诊断及治疗靶点,是目前亟待解决的任务。MicroRNAs(miRNAs)是一种长约22nt的单链小分子RNA。广泛存在于真核生物中,是一组不编码蛋白质的短序列RNA,可通过与mRNA分子序列互补相结合,参与基因转录后水平调控,呈现出组织特异性或发育阶段特异性表达特征。近年来,随着生物信息学的迅猛发展和研究手段的进步,越来越多miRNAs分子在各种生物中不断被揭示,目前已有700多个miRNAs被发现,调控机体内1/3以上基因表达,参与生命过程中一系列的重要进程,包括胚胎发育、干细胞分化、细胞增殖与凋亡,造血生成及激素分泌等多种生物学过程。越来越多的证据表明,miRNAs参与癌症的发生。研究发现,在多种肿瘤组织及细胞系中检测到miRNAs的异常表达,50%以上的miRNA基因位于肿瘤相关的基因组区域或脆性位点,可能通过调节体内某些抑癌基因或癌基因的表达,在肿瘤的发生发展中发挥重要致癌或抑癌的功能。有研究报道,miR-21通过调节PTEN、PDCD4、TPM-Ⅰ及TIMPs等抑癌基因的表达,促进细胞增殖和抑制凋亡。已发现其在乳腺癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肺癌、肝癌等多种癌组织中过高表达,是实体肿瘤中最常见的高表达miRNAs之一,在肿瘤的发生发展中可能起到一个癌基因的作用。目前,已相继有研究证实,在卵巢癌组织、病人血清及外周血小体中检测到多种miRNAs的异常表达,其中miR-21不仅在卵巢癌组织中过高表达,而且在病人血清及外周血小体中也同样检测到miR-21的异常表达,提示miR-21在卵巢癌的发生发展中可能具有不容忽视的重要地位。但有关miR-21在卵巢癌发生发展中的功能及作用机制国内外尚未见报道。本研究目的是检测miR-21及PTEN在上皮性卵巢癌中的表达,并通过RNA干扰技术抑制卵巢癌细胞系中miR-21的表达,观察miR-21对PTEN的影响及miR-21对细胞增殖、迁移及侵袭能力的调控作用。探讨miR-21在卵巢癌发生发展、侵袭转移等过程中的作用机制,为寻找卵巢癌的诊断及治疗新靶点提供理论依据。目的：检测上皮性卵巢癌组织中miR-21及PTEN蛋白的表达,分析miR-21异常表达与PTEN蛋白的相关性及其与卵巢癌临床分期、组织分级、病理类型等特征间的关系,初步探讨miR-21及PTEN在卵巢癌分子发病中的作用。方法：采用茎环实时荧光逆转录聚合酶链反应(stem-loop real-time RT-PCR)检测上皮性卵巢癌组织、良性上皮性卵巢肿瘤及正常卵巢组织标本中miR-21表达。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(SP)免疫组化方法检测上述组织中PTEN蛋白表达。结果：1.miR-21在卵巢癌组织中的相对表达量(2-△△CT)为4.849±1.813,显著高于良性卵巢肿瘤(1.133±0.291)及正常卵巢组织(P<0.01),在良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织间miR-21表达量无明显差异。2.miR-21在Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌组织中表达量为5.603±1.787,明显高于其在Ⅰ、Ⅱ期组织中表达3.341±0.254(p<0.01)；在低分化卵巢癌组织中表达量为7.057±1.552,明显高于其在中高分化癌组织中表达3.845±0.680(p<0.01)；在淋巴结转移组表达量为7.095±1.728,明显高于无淋巴结转移组4.100±1.070(p<0.01);miR-21在浆液性、粘液性及内膜样卵巢癌组织中的相对表达量无明显差异。3. PTEN在卵巢癌组织中阳性表达率为41.66%,明显低于卵巢良性肿瘤(83.33%)及正常卵巢(100%)；在Ⅲ、Ⅳ卵巢癌组织中PTEN阳性表达率明显低于Ⅰ、Ⅲ期(25%vs 75%,P=0.001)；在低分化卵巢癌组织中阳性表达率明显低于中高分化(10.71%vs85%,P=0.000)；在淋巴结转移组.PTEN阳性表达率为16.66%,明显低于无转移组50.00%(P=0.034)。miR-21及PTEN均与组织病理类型无关。4.相关分析结果表明,卵巢癌组织中miR-21表达量与PTEN阳性表达率存在显著负相关(r=-0.447,P<0.01)；结论：miR-21在上皮性卵巢癌组织中高表达,且与卵巢癌分期、组织分级及淋巴结转移密切相关,在卵巢癌发生发展中发挥重要的癌基因作用。miR-21与PTEN蛋白表达呈负相关,二者可能共同参与卵巢癌的发病机制。目的：拟通过siRNA干扰卵巢癌细胞系中miR-21的表达,分析降调miR-21的表达后对卵巢癌细胞中PTEN蛋白表达及细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响,进一步揭示miR-21在卵巢癌分子发病中的作用机制。方法：选用卵巢癌细胞系OVCAR3进行体外培养,采用shRNA表达载体法,根据miR-21的两个成熟片段,设计合成干扰miR-21的siRNA序列,并与表达载体pSIREN-RetroQ连接重组,合成质粒pSIREN-miR-21-1、pSIREN-miR-21-2及pSIREN-miR-21-Neg,分别转染卵巢癌OVCAR3细胞系,干扰miR-21在OVCAR3中的表达,同时设立空白对照组。采用茎环实时荧光逆转录聚合酶链反应(stem-loop real-time RT-PCR)检测转染后细胞系中miR-21表达。Western blot方法检测转染后细胞系中PTEN蛋白表达,应用MTT实验、划痕实验和Transwell细胞侵袭实验方法分析转染后细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化。探讨miR-21在卵巢癌发生发展中的可能作用机制。结果：1. Real time RCR结果显示pSIREN-miR-21-1和pSIREN-miR-21-2转染组细胞中miR-21相对表达量(2-△△CT)为0.26±0.08、0.19±0.06,明显低于阴性对照(1.26±0.21)及空白对照组(1.0±0.19),说明两组干扰质粒均具有良好的干扰效果。转染72小时后,Western blot检测PTEN在pSIREN-miR-21-1和pSIREN-miR-21-2组中表达明显上调,pSIREN-miR-21-neg组无明显变化。2.MTT检测转染后细胞增殖活力,显示在转染pSIREN-miR-21-1和pSIREN-miR-21-2组中,OVCAR3细胞增殖的抑制率分别为23.9%和29.4%,均明显高于对照组(p<0.05,p<0.01),说明肿瘤细胞增殖能力的下降。4.划痕实验结果显示：经过48小时无血清培养后,空白对照组和转染pSIREN-miR-21-neg组中的划痕已经基本长满细胞,而pSIREN-miR-21-1组中有少量细胞,但仍可见明显划痕。pSIREN-miR-21-2组愈合最差,划痕中央无细胞。提示转染pSIREN-miR-21-1和-2组中细胞的活能力受到明显的抑制。5. Transwell实验：转染pSIREN-miR-21-1和pSIREN-miR-21-2组中24小时内穿透小室聚碳酸酯膜的细胞数为40±3.56和29.5±2.38,明显低于空白对照组(73±2.16)和阴性对照组为(69±1.83),卵巢癌细胞在转染pSIREN-miR-21质粒后,侵袭能力也明显下降。结论：干扰质粒pSIREN-miR-21能够成功抑制卵巢癌细胞系中miR-21表达,直接导致PTEN蛋白表达增加,进而对卵巢癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力产生抑制。说明miR-21通过PTEN调控卵巢癌细胞的恶性生物学行为,是导致卵巢癌发生发展及浸润转移的重要调节机制。