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目的:头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,虽然近年来针对头颈部鳞癌的治疗手段有了明显提高,但是其复发率和病死率仍居高不下。因此深入研究挖掘头颈鳞癌发病机制并试图寻找能精确预测其预后的分子靶标,对实现头颈鳞癌各体化治疗意义重大。TROP2(人滋养层细胞表面抗原2)目前被广泛证实在多种上皮源性癌症中(包括喉癌、鼻咽癌)高表达,且与肿瘤的进展及不良预后密切相关。然而TROP2在头颈肿瘤中高表达的原因、其上游调控因素及TROP2的下游传导通路目前仍不十分清晰。环状RNA(circRNA)和微小RNA(miRNA)作为调节因子在肿瘤的发生、转移中起关键作用,是当前肿瘤研究领域中的重点。因此,本研究在探讨TROP2在头颈鳞癌组织中表达水平及其与病人预后相关性的基础上,进一步在体外、体内实验中,通过沉默TROP2,明确其对肿瘤细胞增殖、侵袭及转移的作用机制。并重点分析circRNA和miRNA对TROP2的靶向调控作用及下调信号转导通路。方法:本研究首先在收集的42例喉癌及下咽癌患者样品中,采用免疫组化方法检测TROP2蛋白的表达水平并与癌旁组织做比对;通过Kaplan-Meier生存曲线,Log-rank检验,单因素、多因素Cox回归分析模型,结合临床病理资料,分析TROP2表达对患者的复发、总体生存时间和无病生存时间的影响。其二,通过qRT-PCR筛选两种TROP2高表达头颈鳞癌细胞株;采用脂质体转染siRNA法,构建沉默TROP2细胞株(Fadu及SCC-9);并通过qRT-PCR法及Western Blot法对沉默TROP2在mRNA及蛋白水平加以验证。采用MTS法,Transwell小室及基质胶侵袭小室检测沉默TROP2后对头颈鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的体外作用机制;通过构建沉默TROP2的荷瘤小鼠动物模型,观察肿瘤生长情况并采用免疫组化法检测移植瘤中Ki-67的表达水平,研究沉默TROP2对体内肿瘤形成的抑制作用。其三,应用5种生物信息靶基因预测软件寻找靶向调控TROP2的潜在miRNAs,通过KEGG及GO途径分析生物学效应,筛选miRNAs;利用qRT-PCR方法检测它们在头颈鳞癌细胞株的表达水平;采用qRT-PCR及Western blot法检测在转染miRNAs模拟物,上调miRNAs后对TROP2表达水平的影响;应用载体克隆技术,构建TROP2 3’UTR结合位点和突变结合位点重组质粒,通过双荧光素酶基因报告实验验证miRNA(miR-488-3p)与TROP2的直接靶向作用;采用Western blot法检测沉默TROP2后其下游传导通路(ERK/MAPK通路及PI3K/AKT通路)密切相关的蛋白分子ERK1/2,AP-1和AKT水平,明确TROP2参与调节头颈鳞癌发生、发展传导通路的关系。最后,通过circRNA数据库和miRNA靶基因数据库筛选可特异性结合miR-488-3p的circRNA(circ-0000495);采用qRT-PCR检测circ-0000495在头颈鳞癌细胞株中的表达水平及应用RNA酶处理前后的线性和环状circ-0000495的表达水平,验证circ-0000495的稳定性;采用qRT-PCR法检测转染了miR-488-3p模拟物的Fadu细胞中的circ-0000495、miR-488-3p及TROP2表达水平,探讨三者之间的调控作用;最后通过双荧光素酶基因报告实验验证circ-0000495对miR-488-3p的直接靶向作用。结果:TROP2与头颈鳞癌的复发预后密切相关。实验结果显示TROP2在头颈鳞癌组织中呈高表达,且在复发组的表达水平明显高于非复发组的表达水平(p<0.05);Kaplan-Meier生存曲线显示TROP2高表达组患者的总生存期(p=0.027)和无病生存期(p=0.015)明显较TROP2低表达组差,表明TROP2高表达与头颈鳞癌的复发、总生存期及无病生存期密切相关;在对患者的其他临床病理参数的单因素,多因素Cox回归分析中,仅TROP2表达水平与总生存期和无病生存期密切相关,说明TROP2是头颈鳞癌患者预后的一个独立影响因素(p值分别为0.031和0.018)。沉默TROP2对体外头颈肿瘤细胞的生长抑制及体内抑瘤作用。头颈鳞癌细胞株Fadu及SCC-9因异常高表达TROP2而被选择用于体外沉默TROP2实验。通过siRNA干扰技术,将特异性抗TROP2的siRNA通过脂质体介导的转染方法成功构建沉默TROP2细胞株。结果发现在转染后48小时,两个细胞系的TROP2mRNA表达均显著减少,分别减少了38%及22%(p<0.05),TROP2蛋白的表达水平也显著下降。此外,沉默TROP2后,Fadu及SCC-9细胞增殖活力显著下降,尤其是在48小时后增殖活力下降最明显(p<0.05);沉默TROP2后,Fadu及SCC-9细胞的迁移能力及侵袭能力明显下降,分别为对照组的75%和55%(迁移能力,p<0.01),及60%和48%(侵袭能力,p<0.05)。荷瘤动物研究显示,沉默TROP2后小鼠移植瘤体积明显比对照组小,且随着时间的延长差异显著(p<0.05)。此外,小鼠移植瘤中肿瘤细胞增殖标志物Ki-67的表达在沉默TROP2后明显比对照组降低(p<0.01),说明沉默TROP2后可抑制肿瘤生长。miR-488-3p是TROP2的特异上游调控miRNA。TROP2通过调节PI3K/AKT与ERK/MAPK信号传导通路调节头颈鳞癌发生发展。三个miRNAs:miR-15a-3p、miR-488-3p及miR-550b-2-5p被预测出对TROP2具有潜在靶向作用;经在Fadu和SCC-9细胞检测三者基础表达水平后发现miR-488-3p和miR-15a-3p表达一致下调。进一步通过转染miR-488-3p及miR-15a-3p的模拟物筛选发现,转染miR-488-3p模拟物的细胞中TROP2 mRNA及蛋白的表达量明显减少,说明miR-488-3p对TROP2具有调节作用。最后双荧光素酶基因报告实验证实miR-488-3p能够与TROP2 3’UTR上的位点特异性结合,是TROP2的特异靶向miRNA。此外,沉默TROP2后信号通路蛋白分子AKT、p44/42(ERK1/2)及AP-1的磷酸化水平降低,而AKT和ERK1/2的水平没有改变,证明TROP2通过调节PI3K/AKT与ERK/MAPK信号传导通路调节头颈鳞癌发生发展。Circ-0000495通过海绵吸附miR-488-3p,上调TROP2表达。通过circRNA数据库及miRNA靶基因数据库预测出circ-0000495对miR-488-3p具有潜在靶向作用;circ-0000495在三种头颈鳞癌细胞株(Fadu、SCC22和SCC-9)中显著高表达;经RNase R处理后,PCR结果显示线性circ-0000495 mRNA表达在两种头颈肿瘤细胞(Fadu和SCC-9)中明显降低,而环状的circ-0000495表达无明显变化;当在Fadu细胞中转染miR-488-3p模拟物后,结果发现miR-488-3p大幅增高,TROP2表达明显下降(p<0.05),而circ-0000495表达量无明显变化;双荧光素酶基因报告实验证实circ-0000495与miR-488-3p之间存在特异靶向调节作用。结论:本研究揭示TROP2高表达与头颈鳞癌的复发、总生存期及无病生存期变短密切相关,是头颈鳞癌患者预后的一个独立影响因素。体外、体内实验表明TROP2可显著调节头颈鳞癌细胞的增殖、侵袭及转移能力并影响体内肿瘤的形成。值得注意的是,本研究首次在头颈鳞癌细胞中发现circ-0000495异常高表达,并通过特异靶点海绵样吸附miR-488-3p,造成miR-488-3p表达下调;由于miR-488-3p具有TROP2特异靶点,因此下调的miR-488-3p解除了对TROP2的抑制作用,从而造成细胞内TROP2基因的上调表达。上调的TROP2进而通过PI3K/AKT与MAPK信号传导通路调节头颈鳞癌发生、发展和转移。对circ-0000495-miR-488-3p-TROP2调节通路的理解,势必为头颈鳞癌的治疗打开新的思路。