【摘 要】
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中华草龟的生长极其缓慢,在养殖时,除了养殖条件的改善、饲料营养配方升级之外,对生长轴相关基因研究极为重要。本研究利用PCR扩增方法、实时荧光定量分析和酶切技术对中华草龟生长抑素（SS）基因序列进行克隆测序,构建SS基因的系统发育树。并且利用注射外源生长激素的方法,观察向中华草龟注射人生长激素后,对不同性别中华草龟生长轴相关基因SS mRNA、GHR mRNA、IGF-1 mRNA表达情况的影响,探
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中华草龟的生长极其缓慢,在养殖时,除了养殖条件的改善、饲料营养配方升级之外,对生长轴相关基因研究极为重要。本研究利用PCR扩增方法、实时荧光定量分析和酶切技术对中华草龟生长抑素（SS）基因序列进行克隆测序,构建SS基因的系统发育树。并且利用注射外源生长激素的方法,观察向中华草龟注射人生长激素后,对不同性别中华草龟生长轴相关基因SS mRNA、GHR mRNA、IGF-1 mRNA表达情况的影响,探究中华草龟生长激素变化对相关基因的影响以及调控作用,为进一步开展龟鳖类分子生物学研究及指导养殖生产提供理论依据。1.SS c DNA的同源性分析利用与中华草龟亲缘性较近物种的SS保守区域设计引物,通过克隆和测序后获得c DNA核心片段序列294bp。构建系统发育树得知,在爬行类中中华草龟SS c DNA核苷酸序列与锦龟的同源性最高为95.36%,与鳄鱼同源性处于同一分支上,而与蛇和蜥蜴的同源性最低。与鸟类、哺乳类的同源性则逐渐递减。2.SS、GHR和IGF-1基因在各组织的表达差异实时荧光定量对SS mRNA的组织差异性表达进行检测分析,结果表明:SS mRNA在脑、垂体、肝脏、胃、肠都有表达,在脑部表达量最高,在肝脏中表达量最低;GHR mRNA和IGF-1 mRNA在脑、垂体、肝脏、肾脏、胰脏、胃、肠等7种组织中均有表达。雄龟GHR mRNA在脑部表达量最高,其次为肝脏;雌龟肝脏为最高,其次为脑部,两性的脾脏表达量均为最低;雌雄龟IGF-1 mRNA均在肝脏中表达量最高,胃的表达量最低。3.注射外源生长激素后SS基因的表达变化注射外源生长激素后1周,雌、雄个体脑部SS mRNA表达量变化均为反抛物线趋势,雄性表达量在注射第1天少幅度上升后下降,到第4天降到最低值,随后逐渐上升;雌性SS mRNA表达量迅速下降,在第2天达到最低值后逐渐上升,且始终低于对照组。连续注射4周,雄性脑部SS mRNA在第2周表达量显著上调（P＜0.05）达到峰值,在第3、4周均呈现下降趋势,到第4周低于对照组;雌性在第1周SS mRNA表达量有微下调,第2周表达量显著上调（P＜0.05）达到峰值,随后逐步下降,第4周稍微低于对照组。在其他组织中,SS mRNA表达量变化趋势相同,呈现垂体表达量下调,胃和肠表达量上调。4.注射外源生长激素后GHR和IGF-1基因的表达变化连续注射外源生长激素4周,雌、雄个体肝脏GHR mRNA和IGF-1 mRNA表达量变化趋势相似。GHR mRNA表达量在第1周显著上调（P＜0.05）,第2周下降至对照组水平,随后逐渐上升,第3、4周上调达到差异显著水平（P＜0.05）,其他组织的变化不明显。IGF-1 mRNA表达量在第1周上调,第2周下降至对照组水平,随后逐渐上升,雄性在第4周上调达到差异显著水平,同时肾脏表达量显著上调（P＜0.05）,脾脏表达量显著下调（P＜0.05）。而雌性则在第1、3、4周均上调达到差异显著水平（P＜0.05）,在其他组织均无明显变化。中华草龟注射外源生长激素后SS表达量呈现前期增高,后期逐渐降低趋势,初步表明中华草龟的生长抑素对生长激素有负反馈调节作用,但是后期生长抑素的表达量降低,说明生长抑素对生长激素的抑制作用不明显,与此同时,外源生长激素能被GHR识别,并促进了IGF-1表达水平提高。据此推测,中华草龟的生长抑素对生长激素的表达有一定调控作用,而由于其自身的生长激素表达水平低可能导致生长缓慢。
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