背景与目的食管癌(Esophageal cancer,EC)是我国常见的恶性肿瘤之一,占世界食管癌发病的53%,成为第四大癌症死亡原因,在亚洲和非洲的某些地区高度流行。食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌最主要的病理组织学类型,每年约占食管癌总发病率的90%。在中国,食管鳞癌发病具有显著的地域特色,多集中在中国中北部及太行山脉一带,如林州市(河南)和涉县(河北)等。目前,手术结合放化疗的方法是食管鳞癌临床治疗的常用手段,5-氟尿嘧啶、顺铂和紫杉醇是临床常用的食管鳞癌化疗药物,然而,食管鳞癌的发病率仍然在持续上升,不良反应不断出现,术后5年生存率也只有15%～25%,因此,阐明食管鳞癌的发病机制,寻找新的作用靶点,筛选靶向抑制剂,对改善食管鳞癌的治疗现状,提高临床治疗效率,降低疾病带来的痛苦与损失以及提升病人5年生存率,均具有重要的科学意义。PI3-K/AKT/mTOR通路参与癌症转化的机制包括增强细胞增殖与存活、促进细胞侵袭或转移等。AKT蛋白是PI3-K激酶的直接下游分子,可将信号传递至下游100余种底物蛋白,是PI3-K通路的关键节点之一。AKT是一个重要的信号中枢,在多种癌症的发生发展过程中起着决定性的作用,其功能的发挥影响细胞代谢、生长、存活和增殖等多种生理过程。AKT已经被证实在结肠癌、乳腺癌等癌症中通过调控多种信号通路发挥促癌功能,是一个具有潜力的治疗靶点。在食管鳞癌中,AKT分子的功能及作用机制仍然需要系统性研究。有丝分裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)通路是促进肿瘤发生发展的一条重要信号通路。TAOs处于p38 MAPK上游,在p38 MAPK级联信号通路中属于MAP3Ks家族,具有1001个氨基酸残基,可以调节G蛋白偶联受体家族信号通路、细胞骨架的稳定性和细胞存活力,并可在DNA损伤机制中激活p38从而调控细胞周期。抑制TAOK1蛋白功能可以加强中心体富集化的乳腺癌细胞中心体的解聚并破坏有丝分裂,揭示了 TAOK1成为乳腺癌治疗潜在靶标的可能性。目前,TAOK1蛋白激酶在食管鳞癌中的功能尚不清楚,在食管鳞癌中靶向TAOK1激酶的抑制剂也未见报道,因此,研究TAOK1在食管鳞癌中的作用机制并筛选靶向该蛋白的天然小分子抑制剂,有望为食管鳞癌的研究与治疗提供新的作用靶标和治疗思路。天然小分子抑制剂,是一类从植物中提纯出的具有生物活性的化合物,如类胡萝卜素、类黄酮、花青素等。近年来,一些天然化合物被报道具有调节信号转导通路、调控细胞周期、抑制细胞分化和促进凋亡相关基因表达的能力,具有良好的抗癌活性。目前,广泛应用于肿瘤临床治疗的天然小分子药物有紫杉醇、喜树碱(类)、长春碱(类)、人参皂苷Rg3和高三尖杉酯碱等,均取得了有效的治疗效果。因此,筛选并研究靶向蛋白激酶AKT及TAOK1的天然小分子抑制剂,对食管鳞癌的临床预防与治疗具有指导意义。在本论文中,我们分别对蛋白激酶AKT和TAOK1在食管鳞癌中的功能进行了深度研究,探讨AKT和TAOK1蛋白激酶在食管鳞癌中的相关功能及分子机制,明确了其在食管鳞癌中的促癌作用,并评价了通过抑制蛋白激酶AKT与TAOK1的功能来治疗食管鳞癌的意义与可行性。在此基础上,借助Kinase Profiling assay和超级计算机分子对接模型,分别筛选到了 AKT蛋白的天然小分子抑制剂冬凌草甲素和TAOK1蛋白的天然小分子抑制剂白藜芦醇,并通过蛋白下拉、激酶实验、SPR技术等一系列分子生物学和PDX动物模型来进行验证,最终明确了冬凌草甲素和白藜芦醇分别通过靶向AKT和TAOK1蛋白激酶来抑制食管鳞癌的分子机制和研究发现。方法1.通过免疫组织化学法检测AKT蛋白在食管正常组织和癌组织中表达量的变化;采用免疫组织化学法结合蛋白免疫印迹技术评价TAOK1在食管鳞癌组织和细胞中的表达水平;2.采用基因敲减和过表达技术研究AKT蛋白在食管鳞癌中的功能;采用基因沉默、蛋白过表达结合MTT、Soft agar、流式细胞术等技术检测TAOK1在食管鳞癌细胞中的相关功能;3.将AKT特异性小分子抑制剂MK-2206处理细胞,评价MK-2206通过调控AKT功能抑制食管鳞癌的可行性;4.采用CDX或PDX的方法进一步验证TAOK1蛋白在食管鳞癌移植瘤模型中的作用;5.采用Kinase Profiling assay筛选到了 AKT蛋白的天然小分子抑制剂冬凌草甲素,采用激酶实验、蛋白下拉实验并结合ATP竞争性结合实验研究冬凌草甲素与AKT的体外结合机制及IC50值;通过分子对接模型模拟冬凌草甲素分别与AKT1和AKT2蛋白的结合位点及结合模式;6.采用超级计算机模拟程序筛选与TAOK1亲和指数较高的天然小分子化合物并运用MTT比色法筛选该化合物在食管鳞癌中的IC50剂量;通过激酶实验、SPR技术、KINOME ScanTM技术、蛋白下拉以及分子对接模型,验证小分子抑制剂与TAOK1蛋白激酶的结合模式及结合位点;7.采用MTT比色法和Soft agar实验检测天然小分子抑制剂冬凌草甲素和白藜芦醇对食管鳞癌细胞体外增殖的影响;8.采用流式细胞术结合蛋白免疫印迹法检测冬凌草甲素对食管鳞癌细胞周期和凋亡的影响;采用流式细胞术结合蛋白免疫印迹法检测白藜芦醇对食管鳞癌细胞凋亡的影响;9.采用双荧光素酶报告基因法结合蛋白免疫印迹法检测冬凌草甲素对PI3-K/AKT信号转导通路的影响;采用蛋白免疫印迹法检测白藜芦醇对TAOK1调控p38 MAPK信号通路的影响;10.采用人源肿瘤异种移植瘤(PDX)模型,观察冬凌草甲素和白藜芦醇口服给药后分别对食管鳞癌PDX的生长的影响。结果1.p-AKT(Ser473)和AKT蛋白在食管鳞癌组织中显著过表达;AKT在食管鳞癌中发挥促癌基因的功能,其过表达可促进细胞增殖,基因沉默可抑制癌细胞的体外生长;2.MK-2206通过抑制AKT激酶活性显著性降低食管鳞癌细胞的体外增殖;3.冬凌草甲素在食管鳞癌细胞中特异性靶向AKT并显著抑制AKT1和AKT2激酶的体外活性,IC50值分别为8.4±1.34 μM(AKT1)和8.9 ±0.29μM(AKT2);4.冬凌草甲素通过ATP竞争性模式与AKT1激酶的Asp292氨基酸残基形成两个氢键而结合,与AKT2激酶的Asp293及Lys277氨基酸残基分别形成一个氢键而结合;5.冬凌草甲素通过靶向AKT1/2蛋白激酶显著抑制食管鳞癌细胞的体外增殖和克隆的形成,阻滞细胞周期G2/M期进展并促进细胞凋亡,下调PI3-K/AKT信号转导通路并显著抑制食管鳞癌PDX模型的生长;6.TAOK1蛋白在食管鳞癌组织和细胞中过表达,在晚期食管鳞癌组织中过表达现象尤为明显;7.TAOK1基因沉默显著抑制食管鳞癌细胞的增殖和克隆的形成,将细胞周期阻滞在G1期,并下调p38 MAPK信号通路;TAOK1基因沉默显著抑制食管鳞癌CDX及PDX的生长;TAOK1蛋白过表达促进食管鳞癌细胞的体外增殖及克隆形成能力,促进细胞周期进展,并上调p38 MAPK信号通路;TAOK1蛋白过表达促进食管鳞癌CDX的生长;8.在超级计算机对接得到的候选天然小分子化合物中,白藜芦醇在食管鳞癌细胞中具有最小的IC50值;9.白藜芦醇对TAOK1蛋白激酶具有极高的亲和力和极小的解离常数,在食管鳞癌中特异性靶向TAOK1并显著抑制TAOK1激酶的体外活性;10.白藜芦醇有效抑制食管鳞癌细胞的体外增殖、克隆的形成并诱导细胞凋亡的发生;白藜芦醇通过靶向TAOK1蛋白激酶显著抑制食管鳞癌PDX的生长并下调相关MAPK通路。结论1.AKT蛋白激酶在食管鳞癌组织中过表达,其基因敲减或过表达可分别抑制或促进食管鳞癌细胞的增殖,在食管鳞癌中发挥促癌功能。2.冬凌草甲素以ATP竞争性模式与AKT蛋白激酶结合并抑制其活性。3.冬凌草甲素通过靶向AKT蛋白抑制食管鳞癌细胞的体外增殖、周期进展并促进凋亡的发生,通过抑制PI3-K/AKT信号转导通路显著减弱食管鳞癌PDX的生长。4.TAOK1蛋白在食管鳞癌组织和细胞中过表达,作为促癌基因促进食管鳞癌细胞的增殖、细胞周期进展并调控p38 MAPK信号通路。5.白藜芦醇在食管鳞癌中特异性靶向TAOK1并显著抑制TAOK1激酶的体外活性。6.白藜芦醇通过靶向TAOK1有效抑制食管鳞癌细胞的体外增殖,诱导细胞凋亡的发生,下调p38 MAPK信号通路并显著性减弱食管鳞癌PDX的生长。