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肝纤维化是所有慢性肝病的共同病理改变过程，其实质是细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的合成增多、降解减少，导致其在肝内过度沉积。在ECM降解过程中，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）发挥了重要的作用，但MMPs的活性可被机体自身产生的内源性抑制物——基质金属蛋白酶抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinas,TIMPs）所抑制，后者共有4个亚型，而以TIMP-1的作用最为显著。研究表明，肝纤维化过程是可以逆转的，在阻止肝纤维化形成中，一方面需积极抑制胶原过度产生，另一方面应设法增强能降解ECM的MMPs的活性。基于此理论，依据先进的RNAi技术，我们设想通过沉默TIMP-1基因，解除其对MMPs的抑制效应，实现逆转肝纤维化的发生。本课题构建介导TIMP-1基因的RNAi慢病毒载体，以肝星状细胞-T6（hepatic stellate cells-T6，HSC-T6）为研究靶细胞，体外证明了TIMP-1基因沉默的效果，为抗肝纤维化的治疗提供新思路和新靶点。主要的研究内容及方法1.针对TIMP-1基因的RNA干扰载体的构建及鉴定从GeneBank获得TIMP-1编码区的基因序列，遵循筛选RNAi靶基因的一般规则，确定四条19nt的靶序列，分别合成一对互补的寡核苷酸序列，退火后形成双链DNA片段。同时，利用AgeⅠ和EcoRⅠ酶切pGCSIL-GFP载体使其线性化。随之将两者连接，取连接产物转入细菌感受态细胞，并对长出的克隆进行PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序、比对分析，比对正确的即为构建成功的TIMP-1的RNA干扰慢病毒载体（pGCSIL-GFP-shRNA）。利用PCR方法从含有TIMP-1目的基因的质粒中，钓取TIMP-1的基因片段，并将其进行扩增、酶切。同时，对pEGFP-N1-3FLAG载体也进行酶切、纯化。然后将两者定向克隆连接，连接产物转入细菌感受态细胞，并对长出的克隆进行PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序、比对分析，比对正确的即为克隆成功的含TIMP-1靶序列的重组质粒（pEGFP-N1-3FLAG-TIMP-1）。将重组pEGFP-N1-3FLAG-TIMP-1质粒分别与四个不同干扰靶点的慢病毒质粒pGCSIL-GFP-shRNA共转染293T细胞，转染48h收集细胞，抽提蛋白，利用WesternBlot测定，进而筛选出对目的基因TIMP-1有敲减作用的有效靶点。2. TIMP-1基因的RNAi载体在大鼠HSC-T6细胞中抑制效应通过Real-time PCR和Western Blot检测，在HSC-T6细胞中，进一步验证筛选出的含有有效靶点慢病毒载体pGCSIL-GFP-shRNA对TIMP-1的转录和表达的抑制效果。主要结果1.成功构建了TIMP-1基因的RNAi的慢病毒载体。2.筛选出一段有效的干扰靶点，即位于TIMP-1基因的173～192nt位置，序列为5’-GGAACGGAAATTTGCACAT-3’。3.进一步在HSC-T6细胞系中验证了构建的TIMP-1基因的RNAi载体，其对TIMP-1的转录及表达有明显的抑制效果。结论通过外源筛靶及内源验证，我们成功的构建了使TIMP-1基因沉默的TIMP-1的慢病毒载体，为抗肝纤维化治疗提供新思路和新靶点。