【摘 要】
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目的:创伤性脊髓损伤（TSCI）中继发性损伤导致的严重后果之一是神经元铁死亡,ACSL4作为脂质过氧化物产生的关键酶,是铁死亡的标志物之一,能够影响细胞对铁死亡的敏感性。TSCI神经元铁死亡过程中ACSL4发挥的作用及机制我们尚不清楚,因此,本研究采取体外实验探究ACSL4对神经元铁死亡的作用及机制,并结合体内实验对上述作用和机制进行验证。方法:本研究首先构建小鼠TSCI模型,使用免疫组织化学技术
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目的:创伤性脊髓损伤（TSCI）中继发性损伤导致的严重后果之一是神经元铁死亡,ACSL4作为脂质过氧化物产生的关键酶,是铁死亡的标志物之一,能够影响细胞对铁死亡的敏感性。TSCI神经元铁死亡过程中ACSL4发挥的作用及机制我们尚不清楚,因此,本研究采取体外实验探究ACSL4对神经元铁死亡的作用及机制,并结合体内实验对上述作用和机制进行验证。方法:本研究首先构建小鼠TSCI模型,使用免疫组织化学技术检测ACSL4的表达水平,采用免疫荧光双染技术对ACSL4进行表达定位。生物信息学技术分析ACSL4相关基因的结果提示ACSL4与v-ATPase的相关性较高。本研究以本实验室构建的ACSL4过表达的小鼠海马神经元稳转细胞系（LV-ACSL4-HT22）作为研究对象,采用铁死亡诱导剂erastin建立神经元铁死亡模型,采用RNAi干扰和药物抑制ACSL4,之后采用CCK-8、Western Blotting、q PCR和荧光探针等技术对ACSL4在神经元铁死亡中的作用及机制进行研究。在构建的小鼠TSCI模型中,检测铁死亡标志物表达情况,免疫组织化学方法检测神经元存活情况,BMS评分评估小鼠运动功能的恢复情况,Western Blotting技术检测ACSL4和ATP6V1A蛋白表达水平。结果:（1）免疫组织化学染色和免疫荧光双染结果可知,在TSCI小鼠脊髓中ACSL4表达上调,且神经元中ACSL4高表达。（2）生物信息学分析结果表明,当诱导ACSL4表达升高时ATP6V1C2表达同样升高,提示ACSL4与v-ATPase关系密切。（3）体外实验表明,RNAi干扰和药物抑制ACSL4能够抑制神经元铁死亡;RNAi干扰和药物抑制ACSL4表达后ATP6V1A表达降低,Lyso Sensor荧光探针检测结果显示RNAi干扰和药物抑制ACSL4能够抑制v-ATPase的功能;Rho Nox-1二价铁离子荧光探针检测结果显示,RNAi干扰和药物抑制ACSL4后,诱导铁死亡的神经元中Fe2+浓度降低。（4）体内实验验证了ACSL4在神经元铁死亡中的作用及机制;在小鼠TSCI模型中,抑制ACSL4能够抑制铁死亡,并提高神经元存活率,促进TSCI小鼠运动功能恢复,同样,在TSCI小鼠模型中抑制ACSL4能够抑制ATP6V1A蛋白表达水平。结论:（1）ACSL4在小鼠TSCI后的脊髓神经元中高表达;（2）在小鼠TSCI中抑制ACSL4能够抑制神经元铁死亡,并改善小鼠TSCI后运动功能的恢复情况;（3）在神经元铁死亡过程中,ACSL4通过调控ATP6V1A从而影响v-ATPase功能,导致神经元内Fe2+蓄积,最终导致神经元铁死亡。
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