论文部分内容阅读
探讨小麦发育调控的分子机制对于开展小麦高产分子育种具有重要意义,DNA甲基化在植物发育调控过程中发挥了重要功能,而CpG结合域蛋白（MBD）是一类识别DNA甲基化信号的重要功能蛋白,直接参与了依赖于DNA甲基化的发育调控过程。本研究系统的分析了小麦中甲基结合域蛋白TaMBD9基因的转录本及其序列特征,并初步探讨了该基因在小麦发育调控过程中的生物学功能。主要研究结果如下:1.基于课题组前期克隆的TaMBD9三个部分同源基因序列,通过对小麦基因组和转录组序列比对分析,共获得TaMBD9基因的54个转录本,分别位于小麦的第4、5和6染色体群,分析不同转录本的序列信息,选择7个编码蛋白质最长的转录本作为TaMBD9基因的代表序列,依据转录本的染色体定位,分别命名为TaMBD9-6AS、TaMBD9-6BS、TaMBD9-6DS、TaMBD9-4AL、TaMBD9-5BL、TaMBD9-5DL1 和 TaMBD9-5DL2。对7个转录本的基因组结构进行分析显示,外显子数目在9-12之间,对其编码的蛋白质分析结果显示,TaMBD9-6AS/6BS/6DS分别编码2092、2088和2091个氨基酸,分子量依次为231.86kDa、231.63 kDa、232.32 kDa,TaMBD9-4AL/5BL/5DL1/5DL2 分别编码 1635、1417、1960 和 1536个氨基酸,分子量依次为183.44 kDa、156.93 kDa、218.16 kDa和170.57 kDa,等电点（pI）在5.44-6.35之间。进一步的结构域分析,TaMBD9基因家族的7个转录本包含6个保守域,其中保守域PHD1Lid2plike在7个转录本中均存在,该保守域在调控常染色质甲基化中发挥了重要作用。对蛋白质三维结构预测,结果显示TaMBD9-6AS、-6BS、-6DS、-5DL1和-5DL2的序列一致性较高,均由8个α-螺旋和6个β-折叠以及无规则卷曲组成,空间结构极其相似,TaMBD9-5BL由1 1个α-螺旋和6个β-折叠以及无规则卷曲组成,由于TaMBD9-4AL较TaMBD9-5BL、-5DL1和-5DL2缺失了 201个氨基酸,TaMBD9-4AL在N端缺失了 2个β-折叠。进化树聚类分析结果显示,小麦TaMBD9-6AS/6BS/6DS/4AL/5BL/5DL1/5DL2基因均与拟南芥AtMBD9同源性最高,同属于MBD家族的第Ⅴ类。对7个TaMBD9基因的转录本进行组织表达特性分析显示,TaMBD9-6AS/6BS/6DS在种子、叶、茎、根和穗中的表达量均较高,TaMBD9-4AL-5BL/5DL1/5DL2则在灌浆期的籽粒中表达量较高,在其他组织中表达量均极低,推测TaMBD9的不同转录本在小麦不同组织中发挥功能。2.为了证实小麦TaMBD9基因在发育调控过程中的生物学功能,利用农杆菌侵染法分别将过表达载体1301-TaMBD9-tORF和1301-TaMBD9-ORF导入拟南芥突MBD9基因的突变体mbd9中,经过筛选鉴定,最终获得6个1301-TaMBD9-tORF、3个1301-TaMBD9-ORF共9个T2代纯合转基因株系。分析了纯合转基因株系中植株的功能恢复情况,结果显示,在拟南芥突变体mbd9中过表达TaMBD9-tORF后,与突变体对照相比,转基因株系抽薹时间平均延迟2-3天,过表达TaMBD9-ORF后,转基因株系较突变体对照组平均延迟1-2天左右,表明TaMBD9-ORF缺少的保守域PHD domain在突变体功能恢复中发挥了一定的作用,纯合转基因株系 tORF-2-5、tORF-2-9、tORF-2-14、tORF-5-19 和 tORF-5-22 的抽薹时间恢复到与野生型Col一致,说明小麦TaMBD9基因在依赖于甲基化的开花调控过程中发挥了一定的作用,进一步对开花过程调控机制的探究仍在进行当中。突变体mbd9还有多侧枝的特点,除了开花时间的不同程度恢复,观察转基因株系的分支情况发现tORF-4-18株系恢复至单主茎无侧枝,这与野生型Col一致。此外,tORF-5-22株系的叶片长、大且扁平,tORF-2-9株系叶柄较长,叶片大,整体植株长势壮。这表明小麦TaMBD9基因的插入并进行过表达,在拟南芥的生长发育过程中发挥了重要的功能,进一步的作用机制仍在进行当中。3.利用大麦条纹花叶病毒（BSMV）介导的基因沉默技术,分析了TaMBD9基因抑制表达后对小麦生长发育的影响。分别接种BSMV病毒于冬麦品种“京841”和春麦品种“豫麦18”,通过qRT-PCR技术检测证明接种目的基因的植株中TaMBD9基因表达量显著降低,观察并统计小麦生长状态和抽穗时间发现:接种了 BSMV-γ-TaMBD9病毒的植株较对照组（接种BSMV-γ 0的植株）明显提前,在冬性小麦品种“京841”未经春化处理下抽穗时间提前13天左右,在春性小麦品种“豫麦18”中抽穗时间提前7天左右,表明小麦TaMBD9基因参与了小麦开花过程中的调控机制。