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木聚糖酶在生产中的广泛应用,要求木聚糖酶具有优良的热稳定性。大部分天然木聚糖酶热稳定性较差,成为在饲料、造纸等行业中应用的瓶颈,因此,对木聚糖酶热稳定性的改良十分必要。课题组前期将C2划分为4个结构元件（U1、U2、U3、U4）融合到GH11木聚糖酶X的N端,筛选得到热稳定性提高的重组酶U1-X和U4-X,表明C2的拆分有利于X的结构稳定。本研究主要工作是对U2-X、U3-X、X-U1、X-U2、X-U3、X-U4和X的纯酶性质进行检测,得到了热稳定结构元件U1和U4。基于已有工作,进一步构建了 X双端融合结构元件的重组酶U1U1、U4U1、DU1U1和DU4U1,期望能得到结构精简、热稳定性和催化能力提高的木聚糖酶。结果如下:（1）重组质粒构建:利用反向PCR构建了 N端引入His标签的pET21 a-HX-U2、pET21a-HX-U3和pET21a-HX-U4。利用两步PCR法构建了 X双端融合结构元件的重组酶pET21 a-U4-X-U 1 和 pET21 a-U1-X-U1。（2）重组酶纯化:重组酶转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达。N端引入His标签提高了 X-U2、X-U3、X-U4上清粗酶与Ni2+树脂亲和力,成功得到纯酶。利用包涵体蛋白8M尿素变性后纯化得到U2-X和U3-X纯酶。利用Ni2+树脂亲和纯化X-U1、X、U1U1、U4U1、DU1U1和DU4U1上清粗酶。（3）最适 pH（pHopt）:X、X-U1、U3-X、U1U1、U4U1、DU1U1 和 DU4U1 的 pHopt是3.8;HX-U2 的 pHopt是 4.0;HX-U3、HX-U4、U2-X 的 pHopt 是 4.2。相对于 X,融合了结构元件的重组酶均不同程度提高了pHopt。HX-U3、HX-U4和U2-X的pHopt提升了0.4个单位,pH4.6时HX-U4仍有95%的相对残余酶活。（4）最适温度（Topt）:重组酶 X-U1、HX-U2、HX-U3、HX-U4、U2-X、U3-X、U1U1、U4U1、DU1U1和DU4U1与X的Topt一致,都是46℃。X-U1、U2-X和U3-X相对残余酶活随温度的变化趋势相对平缓。X-U1尤为突出,50℃时依然有99%的活性,温度适应性较好。（5）半失活时间（t1/2）:重组酶 X-U1、HX-U2、HX-U3、HX-U4、U2-X、U3-X、U1U1、U4U1、DU1U1 和DU4U1 与 X在 50℃的t1/2分别为:346.2 min、31.5 min、99.3 min、173.1 min、15.0 min、13.1 min、21.1 min、23.9 min、24.8 min、10.7 min、22.3 min。相对于 X 的半失活时间,X-U1、HX-U2、HX-U3、HX-U4均表现了对t1/2的提高,其中X-U1提升的t1/2时间最长是X的15.5倍。这个结果表明了结构元件U1和U4对于维持重组酶结构稳定发挥了重要作用,U1、U4融合X能有效改良木聚糖酶的热稳定性。（6）酶促动力学参数:重组酶 X-U1、HX-U2、HX-U3、HX-U4、U2-X、U3-X、U1U1、U4U1、DU1U1 和 DU4U1 与 X 的 Km 值依次为:7.4、4.9、8.3、3.6、3.1、6.4、6.6、5.4、4.8、3.1和3.7 mg/mL。相较于X,只有HX-U4和U2-X的底物亲和力略有提升。重组酶Kcat值分别为:875.8、41.6、39.0、15.9、87.8、113.8、24.3、46.9、15.7、112.2 和 529.9 S-1,X-U1 的 Kcat值相对X有明显提高,表明C端融合U1促进X催化能力的提升。通过重组酶的纯酶性质检测,得到了 C2的热稳定相关结构元件U1和U4,同时发现U2、U3和U4提升重组酶pHopt,U2和U4对重组酶亲和力有略微提升。X-U1展现了良好的热稳定性的同时提升了木聚糖酶的催化能力,具有巨大的潜在应用价值。但是U1U1、U4U1、DU1U1和DU4U1并没有表现出预期的良好热稳定性,后期需要进一步研究结构元件改善X热稳定性的机理。通过对C2结构元件的拆分,为酶分子的改造提供了新的思路。