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目的 探讨靶向JAK2-STAT3信号通路的新型特异性抑制剂SC99对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法 本研究分为三部分:第一部分:建立了大鼠大脑中动脉闭塞再灌注(MCAO/R)模型,运用蛋白质印迹法(Western blot)检测缺血半暗带脑组织中的p-JAK2、JAK2、p-STAT3 和 STAT3 分别在 3h,6h,12h,24h,48h 和 7d 的表达情况。第二部分:分别建立了大鼠MCAO/R模型及体外原代培养小胶质细胞氧糖剥夺再灌注(OGD/R)模型。在体实验中,随机选取144只大鼠分为6组:假手术组(Sham组)、MCAO/R 组、MCAO/R+溶剂组(15μL,侧脑室注射[icv])、MCAO/R+SC99-L 组(5 mmol/L,15μL,icv)、MCAO/R+SC99-M 组(15 mmol/L,15μL,icv)、MCAO/R+SC99-H组(25 mmol/L,15μL,icv),每组24只。基于第一部分的结果,选择MCAO/R后JAK2和STAT3磷酸化程度最高的时间点(24h),观察各组的行为学变化并进行神经功能缺损评分,2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)染色计算脑梗死体积,Western blot检测p-JAK2、JAK2、p-STAT3和STAT3的表达水平,末端脱氧核苷酸转移酶介导的DUTP缺口末端标记(TUNEL)染色、Fluoro-Jade B(FJB)染色检测各组细胞凋亡及坏死情况、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组炎症因子水平、干湿称重法检测各组脑水肿情况;体外实验中,将原代培养小胶质细胞随机分为6组:Sham组、OGD/R组、OGD/R+溶剂组(2μL)、OGD/R+SC99-L 组(5μmmol,2μL)、OGD/R+SC99-M组(10μmmol,2μL)、OGD/R+SC99-H 组(20μmmol,2μL),24h 后 ELISA 检测上清液中促炎及抗炎因子水平,免疫荧光检测小胶质细胞中p-JAK2和p-STAT3的激活情况。第三部分:基于第二部分的结果选择中剂量作为药物在体内(1.5 mmol/L,15μL,icv)和体外(10μmmol,2μL)的最佳剂量。在体实验中,48只大鼠随机分为4组:Sham 组、MCAO/R 组、MCAO/R+溶剂组(15μL,icv)、MCAO/R+SC99-M 组(1.5 mmol/L,15μL,icv)。手术后24小时,Western blot检测各组促炎及抗炎因子水平、免疫荧光检测SC99对小胶质细胞极化的影响;体外实验中,将原代培养小胶质细胞随机分为Sham组、OGD/R组、OGD/R+溶剂组(2μL)、OGD/R+SC99-M组(10μmmol,2μL),24小时后免疫荧光染色检测SC99对小胶质细胞极化的影响。结果1、第一部分:在脑I/R急性期,总JAK2和STAT3水平在各个时间点均没有显著变化(P>0.05),p-JAK2和p-STAT3的水平在再灌注3h逐渐上调,在24小时达到峰值(P<0.001),然后逐渐降低;2、第二部分:在体实验中,Western blot结果显示MCAO/R组中缺血半暗带脑组织中p-JAK2和p-STAT3的水平明显升高,三种剂量的SC99均对其有抑制作用,SC99-M和SC99-H组的抑制作用最强且两组之间没有显著差异(P>0.05)。相应地,不同剂量的SC99均能减少MCAO/R大鼠的脑梗死体积,改善神经功能缺损,减轻脑水肿程度,减少MCAO/R后神经元的坏死及凋亡,其中SC99-M和SC99-H组的作用最强且两组之间没有显著差异(P>0.05);体外实验中,不同剂量的SC99均能下调小胶质细胞中p-JAK2和p-STAT3的水平并促进p-STAT3从细胞质转移到细胞核,其中SC99-M和SC99-H组的作用最强且两组之间没有显著差异(P>0.05)。3、第三部分:在体实验中,免疫荧光显示SC99在MCAO/R后促进小胶质细胞极化为抗炎M2表型(CD206/CD11b 阳性细胞),抑制小胶质细胞极化为促炎M1表型(CD16/CD11b阳性细胞);Western blot显示SC99在MCAO/R后促进M2型小胶质细胞相关抗炎因子(IL-4和IL-10)的产生,抑制M1型小胶质细胞相关炎症因子(TNF-α、IL-1β和iNOS)的产生;体外实验中,SC99在OGD/R后抑制小胶质细胞极化为促炎M1表型生并促进小胶质细胞极化为抗炎性M2型表型,从而发挥保护作用。结论1、MCAO/R可诱导大鼠脑组织中JAK2/STAT3信号通路的磷酸化,且在再灌注24小时磷酸化程度最强;2、SC99可抑制MCOA/R或OGD/R诱导的JAK2/STAT3信号通路的磷酸化并产生神经保护作用;3、MCOA/R或OGD/R后,SC99可抑制小胶质细胞极化为促炎M1表型同时促进其极化为抗炎M2表型而发挥有效的保护作用。