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金线莲是一种珍稀兰科药用植物,目前其组织培养技术已经成熟,但组培苗移栽后成活率低、生长周期长,这些缺点使金线莲栽培业者需要承担巨大的风险,严重制约着金线莲栽培事业发展。与组培苗相比,金线莲共生苗具有抗病、抗逆、适应能力强和生长较快等优点。为了建立金线莲与菌根真菌共生体系,工厂化生产金线莲共生苗,本文利用组织分离法从野生金线莲(Anoectochilus roxburghii)菌根部位分离出菌根真菌,并结合菌株形态、融合群测定及ITS序列分析对菌根真菌进行鉴定,然后利用共生真菌侵染金线莲组培苗幼苗,并通过二元培养及大棚开放性培养两种方式,筛选出优良金线莲品种及其适合共生菌株,最后对大棚培育金线莲共生苗所需环境因子进行了初步研究,为工厂化培育金线莲共生苗打下基础。主要研究结果如下:
(1)从金线莲菌根部位共分离得到32株内生真菌,其中丝核菌类(Rhizocmia sp.)真菌共有10株。经鉴定,10株丝核菌中双核丝核菌与多核丝核菌各为5株,5株双核丝核菌(J1、J4、J5、F1、F7)均分离自福建金线莲,属于AG-P融合群,而另外5株多核丝核菌(G1、G3、G4、G5、G6)分离自广西金线莲,均属于念珠菌根菌属(Moniliopsis)。其中J1、J4和J5,G1和G4两组菌株rDNA-ITS碱基序列完全相同,结合其个体形态及菌丝融合情况分析,可能分别属于两株丝核菌的后代。
(2)经二元培养及大棚开放性培养两次菌种筛选,共获得优良菌株4株:J1、G6、F1、F7。这4株菌株能够显著提高福建金线莲栽培的存活率、鲜重增长率及株高增长率(p<0.05)。其中,J1、G6菌株共生效果最为突出,大棚共生栽培可分别提高金线莲鲜重增长率176.2%和102.2%,株高增长率提高31.69%和26.02%,存活率提高7.78%和8.61%。
(3)来源于福建、广西和台湾的三种金线莲品种中,福建金线莲最容易与共生真菌形成共生关系,共生效果极为明显。此外,福建金线莲组培幼苗与菌根真菌形成共生关系后,可产生类原球茎,从栽培到类原球茎产生前后所需时间不到5天,其它品种无此现象。
(4)单因素实验结果表明:金线莲共生苗生长最适宜温度在23℃左右,温度过低或过高会抑制其生长,但温度升高有利于其叶色形成;接菌能够显著促进金线莲的生长,其中最适合的接种量为3%。金线莲共生苗栽培优化条件为:接种JI菌株体为共生菌株,肥料浓度隔月递增,稀释倍数先后为6000倍、5000倍、4000倍,基质采用泥炭+珍珠岩=3:l,适合光强为l000~20001x。
(5)显微形态观察表明菌丝通过表皮、外皮层细胞及表皮毛进入植物皮层细胞,菌丝通过消解的方式为植物提供营养。通过超微结构观察发现菌丝侵入植物细胞间隙时,引起细胞壁内突,形成内突小球,最后脱落在壁膜之间,细胞壁明显变薄。