FK506是一种由链霉菌发酵生产的聚酮类化合物,主要作为免疫抑制剂用于器官移植、系统性红斑狼疮和特异性皮炎等,与其广阔的市场相比产能仍然不足。目前对FK506生产菌株的研究主要使用菌种选育和发酵工艺优化的方法来提高产量。生产菌株的不稳定性会直接影响次级代谢产物的合成水平和生产成本,同时高产性状的不稳定性极大影响其应用,目前对FK506生产菌株不稳定性原因的研究报道较少。本文主要对FK506高产菌株进行筛选,考察高产菌株种子及发酵过程中不稳定的因素,并对高产菌株的培养工艺进行优化。本文首先建立了抑菌圈初筛、TLC半定量和HPLC定量的多种检测方法。从实验室保藏的FK506产生菌株SIPI-FK-006出发,通过自然筛选得到一株FK506效价为671 mg/L的菌株SIPI-FK-6-S-28。对该菌株进行16Sr RNA测序,初步鉴定其为筑波链霉菌。对菌株SIPI-FK-6-S-28进行紫外诱变、NTG诱变、高糖平板筛选、高盐平板筛选、前体抗性筛选、核糖体工程等一系列选育,得到一株产量提升53.6%的菌株SIPI-FK-ST-18,效价为1030.9 mg/L,选择该菌株作为后续的实验菌株。为解决高产菌株在平板种子和发酵过程中FK506合成不稳定问题,根据文献调研及前期实验,对影响平板种子和发酵培养过程中稳定性的因素进行考察。结果发现,在平板种子培养方面,平板中添加高浓度葡萄糖对平板种子稳定性没有影响;添加双氧水刺激菌株产生氧化应激孢子可以提高平板种子稳定性并促进FK506合成;用高浓度涂布平板的方法传代可以提高平板孢子分布的均匀性和稳定性;平板中添加25μg/ml链霉素可以提高平板种子的传代稳定性;平板在28℃下保存的稳定性优于4℃。另外,在发酵培养方面,发酵培养基中添加消泡剂可以提高发酵摇瓶产FK506的稳定性和产量。由于消泡剂对菌株发酵稳定性的影响较大,对该因素进行进一步考察,包括消泡剂的种类、添加量和添加时间等因素。结果发现,有机硅类、聚醚类和聚乙烯醇类消泡剂对FK506效价都有促进作用,其中有机硅类的效果最为显著;消泡剂最佳添加量为2%;最佳添加时间为发酵培养的第4 d。机理研究发现,消泡剂的添加有利于维持发酵后期菌丝的形态完整,改善前期溶氧,促进糖代谢以及作为迟效碳源供菌株利用。为进一步提高菌株SIPI-FK-ST-18的FK506产量,对培养工艺进行优化,包括平板、种子、发酵培养基及培养条件。结果表明,最佳平板培养基为ISP4培养基。通过单因素筛选及培养基综合考察,最优发酵培养基配方为:麦芽糖4.5%、玉米淀粉1.0%、糊精1.0%、可溶性淀粉1.0%、酵母粉2.0%、酵母提取物0.75%、玉米浆干粉0.8%、赖氨酸0.12%、亮氨酸0.12%、五水硫酸铜0.04%、七水硫酸锌0.04%、碳酸钙0.15%、消泡剂2.0%。对发酵培养条件进行优化,最佳平板培养时间为7～12 d,一级种子发酵最佳培养条件为种子培养时间60 h,接种平板孢子面积1×2 cm~2,接种量12%。二级种子发酵,最佳培养条件为一级种子培养48 h,一级种子接种量10%,二级种子培养36 h,二级种子接种量5%。最佳发酵摇瓶培养条件为发酵初始p H7.1,摇瓶装量25 ml,培养温度为25℃,摇床转速250 rpm。发酵工艺进行优化后,FK506产量提升73.2%,达到1785.3 mg/L。对优化后的摇瓶工艺在10 L发酵罐进行放大培养,发酵效价较优化前提高451 mg/L,达到1152.4 mg/L;通过优化补料,调整转速、消泡剂添加方式及搅拌桨叶,最终FK506发酵效价提高至1547.0 mg/L,较工艺优化前提高120.7%。