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动物界有脊椎动物和无脊椎动物两大类群。在脊椎动物体中不仅存在着适应性免疫系统,同时还具有先天性的免疫系统;而无脊椎动物中仅有先天性免疫系统。脊椎动物中的高等脊椎动物,它们的适应性免疫系统是由T细胞介导的细胞免疫和B细胞介导的体液免疫来进行的。而低等的无颌类脊椎动物中,虽然没有高等脊椎动物中以T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)、B细胞抗原受体(B cell receptor,BCR)和主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)为基础的适应性免疫系统,但是它们也有一种特殊的适应性免疫系统,是通过一类新型可变淋巴细胞受体(variable lymphocyte receptors,VLR)识别特异性抗原形成的适应性免疫系统。目前发现VLR有三种,分别为VLRA、VLRB和VLRC,它们分别存在于三种不同的淋巴细胞亚群上。VLRA和VLRC在无颌类脊椎动物适应性免疫系统中相当于有颌类脊椎动物中的T细胞,而VLRB相当于B细胞。日本七鳃鳗(Lampetra japonica)作为无颌类脊椎动物中的代表,具有很高的研究价值,本研究对VLRA分子进行抗体制备和功能研究,为更深一步了解无颌类脊椎动物七鳃鳗的适应性免疫系统的分子应答机制奠定了基础。本文通过对典型的几个VLRA分子进行氨基酸序列比对,找出了LRRNT、LRR1、LRR可变区、LRRCT、连接肽(connecting peptide,CP)和3’末端(3’-terminus)结构域。由于LRRNT结构域和LRRCT结构域保守性较高,相似率分别为61%和60%,所以又对它们进行了抗原表位预测,结果显示LRRNT结构域和LRRCT结构域的抗原免疫原性都较强,因为VLR是以LRRCT结构域端的锚定蛋白(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)与淋巴细胞表面相连,所以LRRNT结构域作为游离端更适合选做抗原。设计带有酶切位点的LRRNT结构域的序列的引物,采用巢式聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法扩增出LRRNT结构域的互补脱氧核糖核酸(complementary DNA,c DNA)序列,共117bp,编码含有39个氨基酸残基的蛋白质。将VLRA抗原目的片段与p ET-32a(+)表达载体双酶切之后连接,成功构建了VLRA-p ET-32a(+)的原核表达载体,将重组质粒转入至E.coli Rosetta感受态细胞中进行诱导表达,最终确定异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)浓度为0.1mmol/L,28℃诱导2h为最佳条件。采用Ni+柱亲和层析法纯化蛋白,纯化后的重组蛋白作为抗原免疫成年新西兰兔(Oryctolagus cuniculus),第四次加强免疫后一周,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)结果显示,抗体效价已达到1:128000,对新西兰兔进行耳动脉取血,制备抗血清并进行抗体纯化。免疫印迹实验(Western blot,WB)结果显示,该抗体对VLRA重组蛋白以及鳃组织中的VLRA天然蛋白都有较强的特异性识别。我们在七鳃鳗的外周血单个核白细胞、鳃组织和髓样小体中,利用Western blot的实验方法检测了VLRA在各组织中的蛋白质表达谱,结果显示,无论是空白对照组还是免疫组,只有在鳃组织中检测到了VLRA的特异性条带,并且在经PHA免疫36h的鳃组织中的相对表达量是空白对照组的2.48倍,达到了极显著的差异。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)实验结果显示,在约60k D处有一条明显的差异性条带,推测在鳃组织天然蛋白中有与VLRA蛋白相互作用的蛋白,后续结果待质谱鉴定来验证。以上结果说明,VLRA参与了七鳃鳗适应性免疫系统中由PHA介导的免疫应答反应,为后续对探索VLRA可变淋巴细胞受体的作用奠定了基础。