论文部分内容阅读
草鱼是我国重要的养殖鱼类，但是病害频发给草鱼养殖带来很大的经济损失。研究草鱼免疫基因，培育抗病力强的草鱼新品种是一条有效的途径。Toll样受体（TLRs）是固有性免疫系统中的细胞跨膜受体及病原模式识别受体之一，它主要通过识别病原相关分子模式（PAMPs）来启动免疫反应。本研究克隆获得草鱼受体TLR21、TLR20和TR18基因，分析其序列，并采用草鱼呼肠孤病毒和嗜水气单胞菌对草鱼进行诱导，研究这些基因在草鱼不同组织及其受病毒（GCRV）和细菌诱导感染后的表达情况，进行不同基因型与草鱼细菌性败血症的关联分析，取得了如下结果：1.根据斑马鱼的TLR21基因cDNA保守序列设计引物，通过同源克隆技术获得草鱼TLR21基因的部分cDNA片段，采用RACE技术获得草鱼TLR21基因的cDNA全长序列3578bp，其中开放阅读框（ORF）2958bp，编码985个氨基酸，含有24个氨基酸的信号肽。经SMART软件分析，该受体包含17个富亮氨酸区（LRRs）、一个跨膜区和一个TIR保守区。Blast分析发现，草鱼TLR21氨基酸序列与斑马鱼的相似度最高，达到79%。实时荧光定量PCR结果显示：草鱼TLR21基因在所检测的12个组织中均有表达，其中以皮肤、脾脏和肠组织表达量最高，在肌肉、中肾和心脏组织表达量较低；经GCRV诱导后，草鱼TLR21基因在肝脏和脾脏组织的表达量显著下调，而经嗜水气单胞菌诱导后该基因在肝脏和脾脏组织的表达量显著上调。2.根据斑马鱼的TLR20基因cDNA保守序列设计引物，通过同源克隆技术获得草鱼TLR20基因的部分cDNA片段，采用RACE技术获得草鱼TLR20基因的cDNA全长序列3197bp，其中ORF长2835bp，编码944个氨基酸，含有19个氨基酸的信号肽。经SMART软件分析，该受体包含6个LRRs、一个跨膜区和一个TIR保守区。Blast分析发现，草鱼TLR20氨基酸序列与鲤鱼的相似度最高，达到78%。荧光定量PCR结果显示，该基因在所检测的10个组织中均有表达，其中以脾脏、头肾和肝脏组织表达水平较高，在中肾和心脏组织表达量较低；经GCRV诱导后， TLR20基因在肝脏组织显著下调，在脾脏组织4h显著下调然后表现出高表达的水平，在鳃和肾脏组织表达水平均较高；TLR20基因经嗜水气单胞菌诱导后在肝脏组织4h表达水平迅速上调然后迅速下调，在脾脏组织3天内逐渐上升然后在第7天受到显著抑制，在鳃和肾脏组织表达水平较高。3.从本实验室转录组序列获得草鱼TLR18基因的部分cDNA片段，采用RACE技术获得该基因cDNA全长序列3600bp，其中ORF长2559bp，共编码852个氨基酸，含有22个氨基酸信号肽。经SMART软件分析，该受体包含7个LRRs、一个跨膜区和一个TIR保守区。草鱼与斑马鱼的TLR18氨基酸序列相似度最高，高达85%。荧光定量PCR结果显示，该基因在所检测的9个组织中均有表达，其中以脾脏、鳃和心脏组织表达量较高，在肝脏、皮肤和脑组织表达量较低。经GCRV诱导后，TLR18基因在肝脏组织4h显著上调然后受到显著抑制，在脾脏组织3天表达水平显著上调然后第7天表达水平显著下调；经嗜水气单胞菌诱导后，该基因在肝脏组织表达水平受到抑制，在脾脏组织4h和第7天受到显著抑制。4.草鱼TLR21基因的多态性与细菌性败血症的关联分析。采用人工感染嗜水气单胞菌的方法，建立了草鱼易感群体（132尾）和抗病群体（143尾），通过直接测序法筛选SNPs位点。在TLR21基因中共获得了6个SNP位点，并研究这些多态性位点与抗逆性状的相关性。其中，1470T-C位点的基因型频率和等位基因频率在抗性和易感群体中均存在显著性差异（P<0.05），1518A-C位点、2049G-A位点以及3823A-G位点的基因型频率和等位基因频率在抗性和易感群体中均存在极显著性差异（P<0.01）。