构建重组质粒在转基因系斑马鱼的构建中是一项常规工作,传统方法是用Ⅱ型限制性内切酶在目的片段上进行切割,产生黏性末端后,再用DNA连接酶连接到现有表达质粒中,这种方法耗费大量的时间和精力。Golden-gate克隆法利用Ⅱs型限制性内切酶识别位点与酶切位点相分离的特点,产生可以设计的粘性末端,这些末端序列可以是任意四个核苷酸序列。利用Ⅱs限制性内切酶的这些优点,经过优化设计,可以将大量的片段串联起来。本文将Golden-gate克隆法应用到重组质粒的构建当中,并且构建出p（Dsred-N1-ccdB-vector）、p（kana-I SceI-lacZ’-sv40-vector）以及 p（kana-Tol2-I Sce I-lacZ’-vector）三个可直接用于注射的通用载体质粒,可以在短时间内得到几乎所有用于构建斑马鱼转基因系的重组质粒。p（Dsred-N1-ccdB-vector）载体质粒是将商业载体质粒p（Dsred-N1）中Dsred红色荧光蛋白基因用可在转化后直接进行筛选的 ccdB基因替换。p（kana-I Sce I-lacZ’-sv40-vector）载体则在p（Dsred-N1-ccdB-vector）上进一步优化,将筛选基因由ccdB换为了lacZ’基因。同时将更多用于构建斑马鱼转基因系的通用原件如I SceI酶切位点连入载体当中。p（kana-Tol2-I Sce I-lacZ’-vector）载体质粒则在 p（kana-I Sce I-lacZ’-sv40-vector）载体质粒的基础上加入Tol2转座子原件。为了检验以上几种载体的工作情况,将以上几个载体与DNA片段用Golden-gate克隆法构建重组质粒:用p（Dsred-N1-ccdB-vector）载体构建重组质粒p（insulin:mcherry）,并将该质粒注射到单细胞时期的斑马鱼胚胎,成功得到胰腺细胞被红色荧光蛋白标记的具有特异性的转基因鱼系。用p（kana-I SceI-lacZ’-sv40-vector）构建p（hsp:eGFP）和p（Lfabp:CFP）两个重组质粒,将其注射到单细胞时期的斑马鱼胚胎,得到了正确荧光表达模式的鱼系。用p（kana-Tol2-I SceI-lacZ’-vector）载体构建p（Lfabp:e GFP）、p（Hsp:mcherry）、p（elaA:venus）以及p（β-actin:eGFP）四个重组质粒,将得到的质粒分别与I-SceI巨核酸酶以及Tol2转座酶mRNA配成体系,再分别注射到单细胞时期的斑马鱼胚胎,统计F0中基因整合效率以及F0遗传效率。发现在构建斑马鱼转基因系时,由Tol2转座子系统介导的基因整合效率以及F0遗传效率都要高于巨核酸酶I SceI系统,这给构建拷贝数较低的转基因鱼系带来很大便利。另外,本文将Golden-gate克隆法应用至斑马鱼基因大片段的敲除与敲入技术中,用p（Dsred-N1-ccdB-vector）与设计好的donor用Golden-gate克隆法构得到重组质粒,注射到单细胞时期斑马鱼胚胎中,对dkk3b基因进行大片段敲除的同时原位敲入绿色荧光蛋白基因,在F0代得到绿色荧光正确表达的胚胎,F1代中筛选到成功敲除dkk3b基因的杂合子后代。