【摘 要】
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近年来,组织工程的发展为实现组织器官修复与再生提供了新的途径。基因治疗技术与组织工程结合,为人们从基因层面调控细胞行为,实现组织器官的高质量再生提供了新手段。将功能基因负载到支架材料中构建成基因活性材料,可实现基因的高效负载和局部释放。同时,基因与材料的结合方式将直接影响基因转染的关键步骤——基因解离,进而影响转染效率和修复效果。本文利用凝血机制中纤维蛋白原（Fibrinogen）分子间的重要作用
【基金项目】
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国家自然科学基金（51322302）；
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近年来,组织工程的发展为实现组织器官修复与再生提供了新的途径。基因治疗技术与组织工程结合,为人们从基因层面调控细胞行为,实现组织器官的高质量再生提供了新手段。将功能基因负载到支架材料中构建成基因活性材料,可实现基因的高效负载和局部释放。同时,基因与材料的结合方式将直接影响基因转染的关键步骤——基因解离,进而影响转染效率和修复效果。本文利用凝血机制中纤维蛋白原（Fibrinogen）分子间的重要作用——Knob-hole特异性相互作用,构建基因活性水凝胶,并将DNA与材料特异性结合,研究了对基因转染效率的影响。通过酯交换和迈克尔加成反应得到序列为GPRPFPAC多肽（Knob）修饰的透明质酸（Knob-g-HA）,接枝率为10.0%。取DNA初始浓度分别为100、200、500 μg/mL,N/P=10,制备DNA/聚乙烯亚胺（PEI）复合粒子,进一步与150 mg/mL的纤维蛋白原混合,形成DNA/PEI/Fibrinogen三元复合粒子。凝胶电泳结果显示粒子能成功络合 DNA。Knob-g-HA 可与 DNA/PEI/Fibrinogen 在多个 Knob-hole比例下成胶。取Knob:hole为3,制备了一系列不同DNA浓度的基因活性水凝胶。流变测试显示,随着DNA浓度的增加,凝胶的储能模量逐渐增大。DNA初始浓度为500 μg/mL时G”达76.5 Pa。扫描电子显微镜结果可见,不同DNA浓度下水凝胶结构均呈贯穿的网孔状结构;荧光显微镜观察到水凝胶中的DNA以粒子形式均匀分布在不同平面上;细胞实验显示该水凝胶具有很好的生物相容性,包封培养的293T细胞具有良好的活性和增殖速率,并在培养3d后被有效转染,转染率随DNA浓度增大而增大。干细胞由于具有自我更新和多分化潜能,成为再生医学领域最受关注的种子细胞。本文进一步研究了骨髓间充质干细胞（BMSCs）在基因活性水凝胶中的分化性能。首先用表达绿色荧光蛋白的基因（eGFP基因）评价了干细胞的转染能力。结果显示,培养7d后BMSCs开始有效转染,随基因浓度的提高,转染量有所提高。然后采用表达转化生长因子beta 1（TGF-β1）的基因（pDNA-TGF-β1）考察BMSCs在该水凝胶中的分化能力。BMSCs在水凝胶中多呈圆形,可成功转染并表达TGF-β 1,并在TGF-β 1的诱导下,软骨相关的Ⅱ型胶原、SOX-9、Aggrecan等特征基因表达上调;H＆E、阿尔新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色结果显示,该基因活性水凝胶可成功诱导BMSCs分泌软骨相关的蛋白多糖、Ⅱ型胶原等特征成分。DNA浓度越高,培养时间越长,分泌表达越明显,且传递累积在水凝胶网络结构中。以上结果证明,该基因活性水凝胶能实现基因的有效转染,并诱导BMSCs向软骨细胞分化。
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