【摘 要】
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丙型肝炎病毒（HCV）感染造成的肝脏疾病严重威胁公众健康,尽管现有的直接抗病毒药物对HCV慢性感染有95%以上的应答,但有效的疫苗是彻底消除HCV感染和降低HCV相关疾病负担不可替代的手段。由于HCV病毒基因组的高变异,导致近百种不同基因亚型病毒株的出现和严重的免疫逃逸现象。迄今为止,尚未研发出成功有效的HCV疫苗。针对HCV疫苗的研发难点,为了提升疫苗的抗原覆盖度,我们设计和构建了一种模拟HCV
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丙型肝炎病毒（HCV）感染造成的肝脏疾病严重威胁公众健康,尽管现有的直接抗病毒药物对HCV慢性感染有95%以上的应答,但有效的疫苗是彻底消除HCV感染和降低HCV相关疾病负担不可替代的手段。由于HCV病毒基因组的高变异,导致近百种不同基因亚型病毒株的出现和严重的免疫逃逸现象。迄今为止,尚未研发出成功有效的HCV疫苗。针对HCV疫苗的研发难点,为了提升疫苗的抗原覆盖度,我们设计和构建了一种模拟HCVE1E2天然构象的五价蛋白疫苗,为解决HCV疫苗研发难点提供新视角。此外,构建一种HCV感染人源化受体小鼠模型,为进行HCV疫苗在动物水平层面评估提供模型基础。本研究通过优化合成的方式,构建和表达了 HCV五种基因型的E1E2全长融合蛋白（H77-1a、Con1-1b、J6-2a、S52-3a、HK6a-6a型）。经免疫荧光共聚焦和免疫印迹分析提示HCVE1E2融合蛋白是以非共价结合的异源二聚体形式存在,圆二色谱实验确定其二级结构以α螺旋为主。同时表面等离子共振技术SPR、ELISA、流式分析（FACS）技术、HCVcc（JFH1）封闭实验和抗体结合实验表明,E1E2蛋白具有明确的生物学活性和抗原性,说明E1E2蛋白高级构象折叠正确。将五种基因型E1E2蛋白等价混合形成HCV E1E2五价蛋白疫苗,对BALB/c小鼠免疫后,抗血清滴度能达到106,维持时间长。同时获得的抗血清以识别E1E2上构象表位为主,并且对7种不同基因型的HCV病毒具有广谱的交叉中和活性。此外,经ELISPOT实验在E1E2蛋白免疫组脾细胞中检测的IL-4分泌和IFN-γ分泌的T细胞活化信号表明E1E2能引起抗原特异性T细胞反应。以上结果说明五价E1E2蛋白疫苗能诱导良好的免疫应答反应,可进一步评估其主动免疫保护效果。由于HCV感染具有高度的种属特异性,其自然宿主仅有人类和黑猩猩,因此,在新疫苗的研发评估中,实验动物成为限制研究的重要因素。本研究分别运用转基因技术和CRISPR/Cas9技术经显微注射制备HCV四受体（CD81、SR-BI、CLDN1、OCLN）转基因ICR小鼠（4hEFTg ICR小鼠）和STAT1分子敲除ICR小鼠（STAT1-/-ICR小鼠）,两种小鼠进行杂交、自交等繁殖方法获得HCV四受体转基因合并STAT1分子敲除小鼠模型（4hEFTg STAT1-/-ICR小鼠）。在HCV病毒尾静脉注射感染3月后,能在小鼠的血液中检测到HCVRNA,说明在该模型小鼠体内HCV病毒血症能维持至少3个月。综上所述,我们纯化了五种基因型的E1E2蛋白,相较单价E1E2蛋白而言,5价E1E2蛋白在交叉中和抗体反应和T细胞应答诱导上更具有免疫优势,可作为HCV疫苗候选物进一步探索,为HCV疫苗研发提供实验数据参考。此外,成功构建的4hEFTg STAT1-/-ICR小鼠模型,为进行HCV致病机制研究和HCV疫苗在动物水平层面评估提供模型基础。
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