背景和目的当腹腔镜80年代应用于腹部外科以来,一直应用于有选择性的基础体质好的病人。与传统开放手术相比,它可以减少术后疼痛、减轻全身系统性应激反应、降低手术并发症、缩短住院时间、早日恢复工作、减少医疗费用、有美容效果等,这使得腹腔镜手术迅速普及。随着腹腔镜技术的进一步成熟,腔镜手术因其微创性、对急性炎症判断准确性及对炎症潜在的免疫性,腔镜的适应症不断扩大,并用于多种感染性外科疾病的治疗,如急性阑尾炎、急性胆囊炎、消化道穿孔、肾结核等。CO2因其易获得、不可燃、代谢快及化学稳定性常被用做腔镜手术的气腹。早期认为腔镜的刺激小,完全归功于腹腔镜的小切口,但越来越多的数据表明CO2的注入在减轻局部和系统的炎性反应中起到关键性作用。然而,在炎症时是否适合应用腹腔镜及CO2气腹尚有争议。感染可使机体产生免疫反应,而手术操作、CO2气腹会对免疫反应造成一定影响,包括白细胞计数、炎症因子水平等变化。组织创伤引起机体不确定性的术前术后免疫和炎性反应,这种反应在在常规手术中是极其微弱,在常规腔镜手术中甚至观察不到。CO2气腹在应激反应中的作用还没有完全统一的认识,没有足够令人信服的证据表明CO2气腹增加或减少感染的的发生,值得进一步研究。炎性反应早期表现巨噬细胞的活化,释放炎性因子和具有攻击性和非选择性的细胞毒性物质,如自由基。自由基参与机体多种疾病的发生和发展过程,细胞内自由基的大量形成必然侵袭细胞膜,导致膜脂质发生过氧化,膜脂中脂肪酸分解,引起细胞膜结构受损、胞膜通透性改变,从而引起细胞损伤,清除和抑制自由基、提高机体抗氧化能力,是防治疾病发展的重要途径之一。为了更好理解CO2气腹对炎性因子的影响机制,我们通过研究气腹条件下体外巨噬细胞超氧阴离子的释放和线料体功能的改变来探讨炎症条件下CO2气腹腔镜手术的可行性。材料和方法应用鼠肺泡巨噬细胞株NR8383,采用美国Queue多气体培养箱,99%CO2培养干预巨噬细胞以模拟气腹环境。实验前可调节式多气体培养箱低氧环境的准备：由过气孔充入低氧混合气体(99%CO2、1%O2) 20ml/min,30min后密闭,压力控制在15mmHg,温度控制在21℃,相对湿度2%。试验一、CO2气腹对炎症时大鼠肺泡巨噬细胞超氧阴离子的影响。化学发光法是自由基测定中灵敏度最高的方法之一,其原理是化学发光试剂与活性氧自由基反应生成激发态的产物,产物中的电子经非辐射性跃迁回到基态,放出光子。应用酶标仪检测,考察模拟CO2气腹环境及恢复常氧条件下,巨噬细胞自由基的释放。用酵母多糖制造炎症环境,为了解该变化过程有无CO2的特殊作用,采用加入酵母多糖常规规培养的细胞作为缺氧阳性模型对照。试验二、CO2气腹对炎症时大鼠肺泡巨噬细胞线粒体功能的影响。线粒体是细胞能量代谢中心,线粒体功能的变化是触发凋亡级联反应的直接原因。研究通过检测线粒体的功能状态。四甲基偶氮唑盐比色法(MTT方法),是通过快速简便的颜色反应来检测细胞存活数量。其原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成蓝紫色的针状甲月替(Formazan)结晶并沉积在细胞中,结晶物能被二甲基亚砜(DMSO)溶解,用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其吸光度OD值,OD值的高低可间接反映活细胞的数量及其活性。结果实验一：实验对照组与正常对照组比较,各时间点具有显著性差异(P<0.05)。CO2气腹组与实验对照组在1小时、2小时、4小时及恢复常氧条件培养2小时比较具有显著性差异(P<0.05)。恢复常氧条件培养4小时与实验对照组比较无显著性差异。CO2气腹组1小时、2小时、4小时及恢复常氧条件培养2小时和4小时的结果与正常对照组比较具有显著性差异(P<0.05)。实验二、实验对照组与正常对照组比较,各时间点具有显著性差异(P<0.05)。CO2气腹组与实验对照组在1小时、2小时、4小时及恢复常氧条件培养2小时比较具有显著性差异(P<0.05)。恢复常氧条件培养4小时与实验对照组比较无显著性差异。CO2气腹组1小时、2小时、4小时及恢复常氧条件培养2小时和4小时的结果与正常对照组比较具有显著性差异(P<0.05)。试验结论在体外实验考察了炎症环境下CO2气腹对巨噬细胞释放超氧阴离子释放和线粒体功能的测定,结果显示CO2气腹组与实验对照组在1小时、2小时、4小时及恢复常氧条件培养2小时比较具有显著性差异(P<0.05)。恢复常氧条件培养4小时与实验对照组比较无显著性差异。由此,推测炎症条件下CO2气腹能够抑制术中巨噬细胞超氧阴离子的释放和线粒体功能,减少氧自由基的释放,减轻局部的炎症应答,抑制细胞的凋亡,并且这种抑制是短暂及可逆的,有利于保证术后的机体防御功能。创新点1、考察了模拟腹腔镜气腹环境对鼠肺泡巨噬细胞株NR8383的生物学行为的影响。2、提出了气腹条件下通过体外巨噬细胞超氧阴离子的释放和线料体功能的改变来探讨炎症条件下CO2气腹腔镜手术的可行性。3、本研究结果提示：推测炎症条件下CO2气腹能够抑制术中巨噬细胞超氧阴离子的释放和线粒体功能,减少氧自由基的释放,减轻局部的炎症应答,抑制细胞的凋亡,并且这种抑制是短暂及可逆的,有利于保证术后的机体防御功能。